雷奈酸鍶在高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用

張輝 ，冉磊 ，竇群立

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

糖尿病性骨質(zhì)疏松（diabedic osteoporosis，DOP）是糖尿病在骨骼系統(tǒng)中的重要慢性并發(fā)癥之一，其患病率約占糖尿病患者的33%，且呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。DOP作為一種全身代謝性疾病，主要表現(xiàn)為骨量降低、骨質(zhì)下降、骨脆性增加、骨強(qiáng)度降低，常伴有腰背髖部疼痛、持續(xù)性肌肉鈍痛等癥狀。DOP患者骨折風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者顯著增高，而一旦出現(xiàn)骨折，由于患者的特殊機(jī)體狀態(tài)，大大增加了致殘率和致死率，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，并給患者和社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。崔冉等[5]指出，對(duì)于DOP的治療不能單純降低血糖，還應(yīng)結(jié)合抗骨質(zhì)疏松藥物等方面的干預(yù)才能最大程度地提高骨密度，預(yù)防骨折的發(fā)生。

雷奈酸鍶（strontium ranelate，SR）是一種兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收雙重作用的抗骨質(zhì)疏松類藥物，憑借其良好的臨床藥效和生物利用度被臨床推廣使用[6-7]。研究表明，成骨細(xì)胞活性的抑制及其凋亡的增加是導(dǎo)致DOP發(fā)生發(fā)展的重要原因，而SR的促成骨機(jī)制與其對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的促進(jìn)作用息息相關(guān)[8]。基于此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)建立高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷模型，通過對(duì)SR作用后成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞形態(tài)以及骨形成相關(guān)基因與蛋白表達(dá)水平等進(jìn)行探究，旨在系統(tǒng)評(píng)估SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用，以期為SR在治療DOP中的臨床應(yīng)用提供科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MC3T3-E1成骨細(xì)胞系保存于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室；胎牛血清購于杭州四季青公司；青/鏈霉素、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Gibco公司；MTT檢測(cè)試劑盒購于Sigma公司；SR購于Servier公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于Beyotime公 司 ；TRIzol、PrimeScript RT 試 劑 盒 、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購于TaKaRa公司；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、胰 島 素 樣 生 長(zhǎng) 因 子 1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 成骨細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞系，細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞密度達(dá)到80%后，用0.25%的胰蛋白酶?jìng)鞔?duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 高糖環(huán)境細(xì)胞模型構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×105/mL接種于96孔板，待細(xì)胞充分貼壁后，分別換為含 0、10、30、50、80、100 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；隨后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；每孔加入150 μL DMSO溶液并充分振蕩以促進(jìn)晶體溶解，測(cè)定D570nm值，以明確能夠造成成骨細(xì)胞活性顯著降低的最優(yōu)葡萄糖濃度。細(xì)胞活性=［（加藥組D570nm-空白組D570nm）/（加藥組D570nm-空白組D570nm）］×100%。

1.4 SR對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響

將成骨細(xì)胞以1×105/mL接種于96孔板，待細(xì)胞充分貼壁后，分別加入 0.00、0.05、0.50、5.00、50.00、500.00 mmol/L SR溶液，每種濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖能力的影響

實(shí)驗(yàn)分為3組，即對(duì)照組、高糖（HG）組、高糖+雷奈酸鍶（HG+SR）組。HG組細(xì)胞使用含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；HG+SR組細(xì)胞在用含相同濃度葡萄糖的完全培養(yǎng)液進(jìn)行孵育的同時(shí)，分別加入0.05、0.50、5.00、50.00、500.00 mmol/L SR 溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)于相同環(huán)境下，不施加任何干預(yù)。每組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)

采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行檢測(cè)分析。將對(duì)照組、HG組和HG+SR組細(xì)胞配置為1×106/mL濃度，分別加入500 μL結(jié)合緩沖液、5 μL AnnexinⅤ-FITC溶液和5 μL碘化丙啶（PI）溶液，充分混勻并避光反應(yīng)20 min，用流式細(xì)胞儀對(duì)各凋亡階段的成骨細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量分析。

1.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

采用倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus CKX31型）觀察對(duì)照組、HG組和HG+SR組成骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。每組隨機(jī)選擇5個(gè)視野，用20倍鏡采集圖像，并對(duì)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量分析。

1.8 RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)

將對(duì)照組、HG組和HG+SR組成骨細(xì)胞以2×105/mL接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%后，用TRIzol試劑裂解各組細(xì)胞并提取總RNA，以2.5 μg上樣量，采用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后以β-actin為內(nèi)參基因，用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒和CFX Connect型qRT-PCR儀對(duì)樣本進(jìn)行基因擴(kuò)增，采用 2-ΔΔCt法分析目的基因的表達(dá)水平。引物相關(guān)序列見表1。

1.9 酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)

采用ELISA試劑盒對(duì)各組成骨細(xì)胞的BMP-2和IGF-1蛋白分泌情況進(jìn)行檢測(cè)。收集各組成骨細(xì)胞的培養(yǎng)液，向酶標(biāo)板的樣本孔中分別加入稀釋至1/5的上清液各50 μL，同時(shí)向標(biāo)準(zhǔn)品孔中依次加入 0、12.5、25、50、100 pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品各 50 μL，并向每孔加入100 μL酶標(biāo)試劑，每組樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用封板膜封板后將酶標(biāo)板置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用洗滌液對(duì)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品孔進(jìn)行漂洗。隨后分別依次加入顯色劑A、B液各50 μL，充分混勻后避光孵育15 min。最后，向每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本的D450nm值。

表1 qRT-PCR引物及序列

圖1 不同濃度高糖環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析檢測(cè)組間差異，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響

不同濃度的葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響如圖1所示。方差分析結(jié)果表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.046，P＜0.001），說明不同濃度的葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞活性的抑制作用不同。Dunnett-t檢驗(yàn)結(jié)果表明，10、30 μmol/L的葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞活性無顯著抑制效果（P＞0.05）；而用50、80及100 μmol/L的葡萄糖對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞誘導(dǎo)3 d后，成骨細(xì)胞活性較對(duì)照組均顯著降低，抑制率分別為39.66%±4.89%（P=0.001）、66.89%±8.66%（P＜0.001）、76.89%±4.70%（P＜0.001）。

2.2 不同濃度SR對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響

圖2 不同濃度SR對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響

不同濃度的SR對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響如圖2所示。方差分析結(jié)果表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.303，P＜0.001），說 明 不 同 濃 度 的 SR 對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞活性的作用效果不同。Dunnett-t檢驗(yàn)結(jié)果表明，0.05和5.00 mmol/L的SR對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的促進(jìn)作用較對(duì)照組均無明顯差異（P=0.406），50.00和500.00 mmol/L的SR則對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.001）。

2.3 不同濃度SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖能力的影響

研究表明，MC3T3-E1細(xì)胞在含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液的高糖環(huán)境下細(xì)胞活性較對(duì)照組均被顯著抑制（F=21.051，P＜0.001）；而用不同濃度的SR對(duì)高糖環(huán)境下的MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行3 d干預(yù)后，0.50與50.00 mmol/L的SR對(duì)高糖損傷的成骨細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用（P＜0.001，P=0.016），0.05與500.00 mmol/L的SR對(duì)高糖作用后的成骨細(xì)胞則無顯著保護(hù)作用（P＞0.05），且高濃度SR作用后會(huì)加重高糖對(duì)成骨細(xì)胞活性的損傷作用。

2.4 SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡水平的影響

圖3 不同濃度SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活性的保護(hù)作用

SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞各凋亡細(xì)胞分布圖及其對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。當(dāng)用含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行孵育后，HG組細(xì)胞的凋亡率（28.92%±1.27%）較對(duì)照組（7.49%±0.86%）顯著增加（P＜0.001）。當(dāng)用能夠?qū)Ω咛黔h(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活性具有顯著保護(hù)效果的0.50 mmol/L的SR對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育后，HG+SR組細(xì)胞的凋亡率（20.05%±1.38%）較HG組顯著降低（P=0.006），與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.012）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SR能夠有效降低高糖環(huán)境對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的損傷，對(duì)細(xì)胞具有一定程度的保護(hù)作用。

2.5 SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

圖4 SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡水平的影響

圖5 SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖5所示。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)較完整，細(xì)胞密度較大，多呈星型，多數(shù)細(xì)胞的延展性較好。當(dāng)用含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行損傷后，HG組細(xì)胞密度降低，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞表面積縮??；而當(dāng)用0.50 mmol/L的SR對(duì)高糖環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)后，HG+SR組細(xì)胞形態(tài)較HG組明顯改善，細(xì)胞延展性有一定程度的恢復(fù)，細(xì)胞表面積增大，但細(xì)胞密度較對(duì)照組仍明顯降低。

2.6 SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的影響如圖6所示。80 μmol/L葡萄糖的高糖環(huán)境顯著降低了MC3T3-E1成骨細(xì)胞的Runt相關(guān)轉(zhuǎn) 錄 因 子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型膠原蛋白（collagen-1，COL-1）的mRNA水平（P=0.016，P=0.038，P=0.012）；而用0.50 mmol/L的SR對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)后，HG+SR組細(xì)胞的Runx2、OCN和COL-1的mRNA表達(dá)水平均較HG組顯著增加（P=0.008，P=0.022，P=0.040）。

2.7 SR對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白分泌水平的影響

SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞BMP-2和IGF-1蛋白分泌水平的影響如圖7所示。80 μmol/L葡萄糖能夠使BMP-2和IGF-1的蛋白分泌水平被顯著抑制（P=0.002，P=0.035），而0.50 mmol/L的SR則能夠顯著逆轉(zhuǎn)BMP-2和IGF-1蛋白分泌水平的降低（P=0.002，P=0.035）。

3 討論

DOP是嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，患者的骨量顯著減少，骨微結(jié)構(gòu)被破壞，骨折風(fēng)險(xiǎn)大大增加。據(jù)報(bào)道，1型糖尿病患者骨量減少和DOP發(fā)病率為48%～72%，2型糖尿病患者DOP發(fā)病率為20%～60%，且骨質(zhì)丟失速率顯著增加[9-10]。因此，積極探索合理有效的DOP治療手段，對(duì)于改善DOP患者生存質(zhì)量、降低其致殘率和致死率具有重要的臨床意義。目前治療糖尿病的藥物主要包括胰島素及各種降血糖藥物，而一些降血糖藥物如磺胺類藥物、噻唑烷二酮類藥物等還能夠造成骨質(zhì)的流失[11-12]，因此對(duì)于DOP的治療還應(yīng)結(jié)合抗骨質(zhì)疏松類藥物進(jìn)行。SR是一種具有促骨形成和抗骨吸收雙重作用的骨質(zhì)疏松治療藥物，大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)SR加速新骨形成、促進(jìn)不同狀態(tài)大鼠/小鼠的骨質(zhì)增加[13]，體外實(shí)驗(yàn)也表明SR能夠有效降低破骨細(xì)胞分化，同時(shí)加速成骨細(xì)胞表型的獲得[14-15]。此外，大量臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)SR絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有一定程度的治療作用，從而大大降低了患者髖骨和椎骨的骨折風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。然而，有關(guān)SR對(duì)于DOP作用效果的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究中，我們通過對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行高糖誘導(dǎo)，探究不同濃度的高糖溶液和SR對(duì)成骨細(xì)胞活性的作用效果，篩選出能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性顯著降低的高糖濃度（80 μmol/L）以及對(duì)成骨細(xì)胞活性具有顯著促進(jìn)作用的SR濃度（0.50 mmol/L），并探討了該濃度SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性、形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能的保護(hù)作用，旨在為SR在DOP臨床治療中的應(yīng)用提供科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖6 SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖7 SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白分泌水平的影響

研究表明，糖尿病患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境對(duì)骨骼細(xì)胞具有重要影響。長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)的機(jī)體，其骨代謝平衡被打破，高濃度的葡萄糖能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化[18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境能夠顯著抑制成骨細(xì)胞增殖水平，而SR則能夠顯著促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖水平的降低。此外，長(zhǎng)期的高血糖環(huán)境能夠引發(fā)機(jī)體晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）的形成和累積，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡并抑制其分化，增加骨膠原的糖化和骨脆性，進(jìn)而降低骨強(qiáng)度[19]。本研究發(fā)現(xiàn)的高糖環(huán)境顯著增加成骨細(xì)胞的凋亡水平也證實(shí)了這一點(diǎn)，而SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用，并且SR能夠顯著改善高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的退變，增加細(xì)胞延展性和細(xì)胞面積，表明SR對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷具有一定程度的保護(hù)作用。

Runx2、OCN和COL-1是骨發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)骨形成和骨重建具有重要的調(diào)節(jié)作用。Runx2作為骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)早期成骨細(xì)胞的增殖和分化，并能影響其他骨形成相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[20]；OCN是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志[21]，而COL-1參與膠原纖維的形成，同樣是骨形成的典型調(diào)節(jié)者[22]。本研究表明，高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的Runx2、OCN及COL-1的基因表達(dá)水平顯著降低，SR干預(yù)則顯著上調(diào)了三者的mRNA表達(dá)水平，而OCN和COL-1的表達(dá)上調(diào)很可能與Runx2的高表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果表明SR干預(yù)能夠通過促進(jìn)骨形成相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與礦化，并對(duì)高糖環(huán)境下的骨形成產(chǎn)生一定程度的促進(jìn)作用。BMP-2也是骨形成和骨傷愈合過程中重要的細(xì)胞因子之一，據(jù)報(bào)道BMP-2能夠顯著增加去勢(shì)大鼠的骨密度，改善骨骼的力學(xué)屬性[23-24]。IGF-1是骨骼中最豐富的生長(zhǎng)因子，具有保護(hù)骨量、促進(jìn)骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖與分化、加速骨礦化結(jié)節(jié)形成、抑制細(xì)胞凋亡的作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)SR能夠有效促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞BMP-2和IGF-1的分泌，進(jìn)一步表明SR在改善成骨細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)骨形成的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究增加了科學(xué)界對(duì)于SR在高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從而為SR在糖尿病機(jī)體中骨形成的促進(jìn)作用提供了新見解，并為其在DOP臨床治療中的應(yīng)用提供了合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。