基于雙熒光和單熒光探針的溶酶體pH值測(cè)定方法比較

姚溢，劉萱

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850

溶酶體是一種直徑0.025～0.8 μm、單層膜包被且形態(tài)多樣的酸性細(xì)胞器，存在于所有真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。溶酶體內(nèi)含60多種酸性水解酶，其作用是分解由胞外進(jìn)入胞內(nèi)或細(xì)胞自身產(chǎn)生的各類物質(zhì)，甚至包括受損的細(xì)胞器。溶酶體內(nèi)酸性水解酶的活性依賴于其低pH值環(huán)境。正常情況下，溶酶體通過水解ATP產(chǎn)生能量，驅(qū)動(dòng)膜表面的V型ATP酶（V-ATPase）質(zhì)子泵復(fù)合物，將胞質(zhì)中的氫離子逆濃度梯度運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)，使溶酶體內(nèi)的pH值維持在4.5～5.0[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，可透膜直接調(diào)節(jié)溶酶體酸度的弱堿性小分子化合物NH4Cl或氯喹、V-ATP酶質(zhì)子泵抑制劑巴弗洛霉素A1等，都可以使溶酶體的pH值上升，從而破壞其水解功能。生理狀態(tài)下，溶酶體低pH值環(huán)境受損會(huì)導(dǎo)致癌癥、休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默癥和其他神經(jīng)退行性疾病等[4-8]。因此，溶酶體pH值的檢測(cè)在科學(xué)研究和疾病診斷中具有重要意義。

目前，溶酶體pH值檢測(cè)方法主要包括酸堿指示劑滴定法、核磁共振法、微電極法和熒光探針檢測(cè)法[8-11]。因?yàn)闊晒馓结槞z測(cè)法具有分辨率高、選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)[12-15]，且有多種熒光探針可供選擇，因此被廣泛使用[16-17]。

熒光探針法多是基于熒光基團(tuán)的結(jié)構(gòu)或發(fā)射光譜會(huì)隨環(huán)境酸堿度的變化而發(fā)生變化來(lái)監(jiān)測(cè)pH值。如基于異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）的pH值測(cè)定方法中，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)在490 nm附近時(shí)，F(xiàn)ITC在535 nm的發(fā)射光強(qiáng)度對(duì)環(huán)境pH值極其敏感，pH值越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，反之則越弱[18]。而四甲基若丹明（tetramethyl rhodamine，TMR）則是一種對(duì)pH值幾乎不敏感的熒光染料，可用于FITC熒光強(qiáng)度矯正。為了使FITC或TMR熒光分子聚集于溶酶體，可將熒光分子與相對(duì)分子質(zhì)量大于10萬(wàn)的葡聚糖（dextran）分子交聯(lián)，制備成FITC/TMR-dextran熒光探針，利用細(xì)胞自身的內(nèi)吞作用，通過內(nèi)體將熒光探針?biāo)腿肴苊阁w。FITC-dextran與TMR-dextran熒光探針在不同條件下熒光強(qiáng)度的比值可精確反映溶酶體的pH值。但是，基于雙熒光染料比值的檢測(cè)方法可能會(huì)因成像過程中光淬滅敏感性差異、染料滲漏等因素而產(chǎn)生系統(tǒng)誤差，從而產(chǎn)生除pH值變化以外的影響[19]。

為避免雙熒光探針可能帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，我們嘗試?yán)肍ITC-dextran單熒光探針進(jìn)行pH值檢測(cè)。相較于FITC在Ex488 nm/Em520 nm的熒光強(qiáng)度對(duì)pH值極為敏感，其在非峰值激發(fā)波長(zhǎng)下（如Ex405 nm/Em422 nm）的熒光強(qiáng)度則不受pH值影響[18]。通過獲取FITC-dextran熒光探針在Ex488 nm/Em520 nm和Ex405 nm/Em422 nm下熒光強(qiáng)度的比值（FIFITC488/FIFITC405）來(lái)測(cè)定溶酶體的pH值，可以有效避免不同種熒光探針之間因光淬滅敏感性差異或串色等因素帶來(lái)的誤差。

本研究利用pH值標(biāo)準(zhǔn)品，在A549細(xì)胞中比較了基于FITC/TMR-dextran雙熒光和FITC-dextran單熒光探針的溶酶體pH值檢測(cè)方法，證明利用FITC-dextran在488和405 nm雙激發(fā)條件下的熒光強(qiáng)度比值同樣可實(shí)現(xiàn)pH值的線性檢測(cè)，且更加簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，可為溶酶體活性相關(guān)研究和相關(guān)疾病診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

人類肺癌肺泡基底上皮細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心,由本實(shí)驗(yàn)室保存。該細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰蛋白酶消化傳代，每周傳代3次。

胰蛋白酶、FITC交聯(lián)的葡聚糖分子（FITC-dextran）（Sigma公司）；巴弗洛霉素 A1（bafilomycin A1）（EMD Millipore公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；細(xì)胞內(nèi)pH校準(zhǔn)緩沖液試劑盒（Invitrogen公司）；TMR交聯(lián)的葡聚糖分子（TMR-dextran）、溶酶體探針（LysoTracker）（Invitrogen公司）。

1.2 FITC/TMR雙熒光探針法

1.2.1 溶液配制

①pH標(biāo)準(zhǔn)品溶液：將100 μL纈氨霉素（20 mmol/L）和100 μL尼日利亞菌素（20 mmol/L）混合成10 mmol/L的預(yù)混液（1000×）。纈氨霉素和尼日利亞菌素都可以與鉀離子形成脂溶性復(fù)合體，在脂膜上促進(jìn)氫離子和鉀離子的交換，使細(xì)胞（包括溶酶體）內(nèi)外pH值相等。分別在10 mL的 pH 標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液 A（pH4.5）、B（pH5.5）、C（pH6.5）、D（pH7.5）中加入10 μL預(yù)混液，制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液A、B、C、D。

②活細(xì)胞成像（live cell imaging solution，LCIS）緩沖液：140 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1.8 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，20 mmol/L HEPES，pH7.4，滲透壓300 mmol/L。

③巴弗洛霉素A1：用160 μL超純水溶解10 μg巴弗洛霉素A1并混勻，制成100 μmol/L的巴弗洛霉素A1母液。

1.2.2 熒光探針標(biāo)記 在共聚焦專用培養(yǎng)皿中用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)A549細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到50%匯合度時(shí)，在避光條件下向培養(yǎng)基中加入FITC-dextran（終濃度1 mg/mL）與TMR-dextran（終濃度0.5 mg/mL）熒光探針，輕輕混勻，37℃避光孵育2 h；隨后，吸除含有熒光探針的培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基輕柔地洗3次，徹底去除未進(jìn)入細(xì)胞的熒光探針；加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)避光培養(yǎng)6 h，使熒光探針有充足的時(shí)間通過內(nèi)吞作用經(jīng)由內(nèi)體進(jìn)入溶酶體。

1.2.3 激光共聚焦檢測(cè) 首先檢測(cè)商品化pH值標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度，用于制作熒光強(qiáng)度與pH值相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。鏡檢前吸去培養(yǎng)基后分別加入pH值為4.5、5.5、6.5、7.5的標(biāo)準(zhǔn)品溶液A、B、C、D，37℃避光孵育10 min，然后置于激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss LSM880）63倍油鏡下，分別用Ex488 nm/Em520 nm（FITC）和 Ex561 nm/Em580 nm（TMR）熒光通道進(jìn)行觀測(cè)并拍照，每個(gè)樣品至少拍攝30個(gè)完整細(xì)胞用于后續(xù)圖像分析。在實(shí)際細(xì)胞樣品溶酶體pH值檢測(cè)時(shí)，鏡檢前須吸去培養(yǎng)基并加入LCIS緩沖液，隨后置于激光共聚焦顯微鏡63倍油鏡下，用相同的熒光通道和成像參數(shù)進(jìn)行觀測(cè)并拍照。溶酶體pH值調(diào)節(jié)藥物巴弗洛霉素A1在鏡檢前6 h加入，終濃度為100 nmol/L。

1.2.4 溶酶體pH值的計(jì)算 使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)至少30個(gè)完整細(xì)胞內(nèi)FITC和TMR的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度（fluoresces intensity，F(xiàn)I）比值FIFITC488/FITMR561制作熒光強(qiáng)度相對(duì)于pH值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（分別以pH4.5標(biāo)準(zhǔn)品的FIFITC488和FITMR561為基準(zhǔn)，對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后再制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程），并通過回歸方程計(jì)算各個(gè)處理組細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的溶酶體pH值。

1.3 FITC單熒光雙激發(fā)法

FITC單熒光雙激發(fā)法與FITC/TMR雙熒光探針法類似。但存在以下不同：①熒光探針標(biāo)記時(shí)，只加入FITC-dextran（終濃度為1 mg/mL）單熒光探針；②激光共聚焦檢測(cè)時(shí)，分別用Ex488 nm/Em520 nm（pH敏感）和Ex405 nm/Em422 nm（pH不敏感）熒光通道進(jìn)行觀測(cè)并拍照；③在pH值計(jì)算時(shí)，使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)至少30個(gè)完整細(xì)胞內(nèi)FITC雙通道激發(fā)的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度比值FIFITC488/FIFITC405制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（分別以pH4.5標(biāo)準(zhǔn)品的FIFITC488和FIFITC405為基準(zhǔn)，對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后再制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程），并通過回歸方程計(jì)算各個(gè)處理組細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的溶酶體pH值。

2 結(jié)果

2.1 葡聚糖交聯(lián)的熒光探針通過細(xì)胞內(nèi)吞標(biāo)記溶酶體

高分子量葡聚糖dextran被細(xì)胞內(nèi)吞后經(jīng)過內(nèi)體運(yùn)輸?shù)竭_(dá)溶酶體，且?guī)缀醪槐唤到?。利用這一特性，與dextran交聯(lián)的熒光分子可最終被運(yùn)送至溶酶體。因此，要準(zhǔn)確測(cè)量溶酶體pH值，必須首先保證熒光探針-dextran完全聚集于溶酶體中。不同細(xì)胞內(nèi)吞的速率不同，所以應(yīng)首先確定A549細(xì)胞中熒光探針-dextran進(jìn)入溶酶體所需的時(shí)間。我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)基中加入FITC-dextran熒光探針，孵育2 h后徹底洗掉未進(jìn)入細(xì)胞的探針，并在正常培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)不同的時(shí)間。與此同時(shí)，在鏡檢前90 min用靶向溶酶體的Lyso-Tracker染料對(duì)溶酶體進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記，通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)FITC-dextran（Ex488 nm/Em520 nm）與 LysoTracker（Ex577 nm/Em590 nm）的共定位。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-dextran標(biāo)記6 h后與溶酶體的共定位最強(qiáng)（圖1）。用ImageJ軟件分析紅綠熒光的共定位比例，F(xiàn)ITC-dextran標(biāo)記6 h與溶酶體共定位的皮爾森相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.7034（圖1），可用于溶酶體pH值測(cè)定。

2.2 利用FITC/TMR雙熒光探針法測(cè)定溶酶體的pH值

確定A549細(xì)胞中FITC-dextran熒光探針進(jìn)入溶酶體的最佳時(shí)間之后，利用FITC/TMR雙熒光探針法測(cè)定A549細(xì)胞溶酶體的pH值。在培養(yǎng)基中同時(shí)加入終濃度為1 mg/mL的FITC-dextran與終濃度為0.5 mg/mL的TMR-dextran熒光探針，孵育2 h后徹底洗掉未進(jìn)入細(xì)胞的探針，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h。隨后，分別加入pH值為4.5（A）、5.5（B）、6.5（C）、7.5（D）的 pH 值標(biāo)準(zhǔn)品，制作熒光強(qiáng)度相對(duì)于pH值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC在Ex488 nm/Em520 nm的熒光強(qiáng)度隨pH值的升高而顯著加強(qiáng)，而TMR在Ex561 nm/Em580 nm的熒光強(qiáng)度受pH值的影響較?。▓D2A），二者的相對(duì)熒光強(qiáng)度比值FIFITC488/FITMR561與pH值基本呈線性關(guān)系（圖2B）。

隨后，利用溶酶體pH值調(diào)節(jié)劑巴弗洛霉素A1（100 nmol/L）處理經(jīng) FITC-dextran與TMR-dextran標(biāo)記的細(xì)胞，并通過激光共聚焦檢測(cè)FITC和TMR的熒光強(qiáng)度（圖2C）。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算其相對(duì)應(yīng)的pH值。結(jié)果顯示，與無(wú)藥物處理的生理組細(xì)胞相比，經(jīng)巴弗洛霉素A1處理的細(xì)胞中溶酶體pH值由生理狀態(tài)下的4.6升高至6.9（圖2D）。

2.3 利用FITC單熒光雙激發(fā)法測(cè)定溶酶體pH值

FITC與TMR在檢測(cè)過程中都存在熒光淬滅衰減現(xiàn)象，且二者淬滅速率不同，會(huì)給FITC/TMR雙熒光探針法帶來(lái)一定的系統(tǒng)誤差。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC熒光強(qiáng)度對(duì)pH值的敏感性依賴于激發(fā)光波長(zhǎng)，其在488 nm激發(fā)光下對(duì)pH值的敏感性最強(qiáng)，而在405 nm激發(fā)光下的熒光強(qiáng)度幾乎不受pH值的影響[18]。為了避免雙熒光探針的系統(tǒng)誤差，我們嘗試?yán)肍ITC-dextran單熒光探針在488 nm和405 nm激發(fā)光下的相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算pH值。在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mg/mL的FITC-dextran標(biāo)記細(xì)胞溶酶體，隨后加入pH值標(biāo)準(zhǔn)品，制作pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線。激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC在Ex488 nm/Em520 nm的熒光強(qiáng)度隨pH值的升高而顯著加強(qiáng)，而在Ex405 nm/Em422 nm的熒光強(qiáng)度受pH值影響較?。▓D3A），二者相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值FIFITC488/FIFITC405與pH值基本呈線性關(guān)系（圖3B）。同樣，利用溶酶體pH值調(diào)節(jié)劑巴弗洛霉素A1（100 nmol/L）處理經(jīng)FITC-dextran標(biāo)記的細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果顯示，與無(wú)藥物處理的生理組細(xì)胞相比，經(jīng)巴弗洛霉素A1處理的細(xì)胞中溶酶體pH值由生理狀態(tài)下的4.5升高至7.6（圖3D），其pH檢測(cè)敏感性與FITC/TMR雙熒光探針法一致。

圖1 利用FITC-dextran熒光探針標(biāo)記溶酶體

值得注意的是，在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中，作為背景對(duì)照的FIFITC405本身也與pH值呈一定程度的負(fù)相關(guān)，但其負(fù)相關(guān)斜率絕對(duì)值0.1815和FITMR561與pH值的負(fù)相關(guān)斜率絕對(duì)值0.1625基本一致，說明TMR與FITC405受pH值的影響基本相同（圖4A）。而且在這2種方法測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中，F(xiàn)IFITC488隨pH值變化的趨勢(shì)重復(fù)性好（圖4B），說明FITC單熒光雙激發(fā)法可替代FITC/TMR雙熒光探針法進(jìn)行溶酶體pH值的測(cè)定。由于FITC單熒光雙激發(fā)法只須使用1種熒光探針，實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，其實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生人為操作誤差的概率也更低，因此更有利于pH值的定量檢測(cè)。

圖2 FITC/TMR雙熒光探針法測(cè)定溶酶體的pH值

3 討論

溶酶體是調(diào)控細(xì)胞代謝的重要細(xì)胞器[20]，檢測(cè)溶酶體的pH值是研究其功能和相關(guān)疾病診斷的基礎(chǔ)。利用熒光探針檢測(cè)溶酶體的pH值已被被廣泛使用，其中又以基于FITC的檢測(cè)法最為普遍。本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，在A549細(xì)胞中比較了基于雙熒光素和單熒光素的pH檢測(cè)法。

目前常用的檢測(cè)溶酶體pH值的方法是FITC/TMR雙熒光探針法，但FITC與TMR的熒光淬滅衰減速率存在差異，且不同光譜間易發(fā)生串色，可能導(dǎo)致潛在的系統(tǒng)誤差。在FITC單熒光雙激發(fā)法中，作為矯正熒光，F(xiàn)IFITC405表現(xiàn)出與FITMR561一致的pH值敏感性，在檢測(cè)巴弗洛霉素A1對(duì)溶酶體pH值的影響時(shí)，2種方法計(jì)算得出的pH標(biāo)準(zhǔn)曲線以及溶酶體pH值高度一致，說明FITC單熒光雙激發(fā)法可替代FITC/TMR雙熒光探針法來(lái)進(jìn)行溶酶體pH值的定量檢測(cè)。由于FITC本身的熒光淬滅并不會(huì)影響其在488和405 nm激發(fā)光情況下的發(fā)射光熒光強(qiáng)度的比值，提示FITC單熒光雙激發(fā)法潛在的系統(tǒng)誤差更小。此外，F(xiàn)ITC單熒光雙激發(fā)法的實(shí)驗(yàn)過程更為簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)[21-23]。

圖3 FITC單熒光雙激發(fā)法測(cè)定溶酶體的pH值

圖4 比較FITC/TMR雙熒光探針法與FITC單熒光雙激發(fā)法對(duì)pH值的敏感性

綜上所述，F(xiàn)ITC單熒光雙激發(fā)法可以替代FITC/TMR雙熒光探針法，其檢測(cè)效果符合實(shí)驗(yàn)室后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)溶酶體pH值的需求，而且操作更簡(jiǎn)單，也更加經(jīng)濟(jì)便宜。本研究為細(xì)胞中溶酶體pH值測(cè)定提供了新方法，為溶酶體功能活性的檢測(cè)和研究奠定了基礎(chǔ)。