人磷酸葡萄糖變位酶5對肝癌細胞生長和遷移的影響

冉芳，施亞嬌，羅沙柳，劉婕，張亞楠，丁麗華，葉棋濃

1.貴州大學 醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025；2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100850

磷酸葡萄糖變位酶5（phosphoglucomutase 5，PGM5）又稱針蛋白（aciculin）或磷酸葡萄糖變位酶相關蛋白（phosphoglucomutase-related protein，PGM-RP），是一種含有567個氨基酸殘基的蛋白，屬于磷酸葡萄糖變位酶（phosphoglucomutase，PGM）家族，是葡萄糖代謝及糖原代謝過程中的關鍵酶，可以催化葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）的雙向轉化。一方面，PGM5催化糖原分解代謝產生的G-1-P轉化為糖酵解過程的第一個中間產物G-6-P；另一方面，PGM5也促進G-6-P轉化為G-1-P，生成合成尿苷二磷酸葡萄糖的底物，該底物是合成多種細胞成分（如糖蛋白）所必需的[1]。1994年，PGM5從人子宮平滑肌中被分離出來，因其氨基酸序列、結構及免疫學特性與PGM1高度相似，因此認為其可能是PGM家族的新成員[2]。1995年Edwards等利用32P標記的PGM1 cDNA的特定基因組文庫探針發(fā)現(xiàn)了一個與PGM1高度同源的序列，又與其他PGM家族成員有明顯區(qū)別，因此將其正式命名為PGM5[3]，并發(fā)現(xiàn)其定位于人類9號染色體（9q21.11）著絲點區(qū)域。

PGM5在細胞中分布于正常骨骼肌纖維細胞外周，細胞與細胞、細胞與基質的連接處[2,4]；在組織中，主要在肌肉組織中集中表達，如平滑肌、骨骼肌和心肌等[5]。過去的20年里，由于PGM5特殊的分布，關于PGM5的研究主要聚焦于其在肌肉組織中的作用。PGM5分布在細胞與細胞、細胞與基質之間，參與介導或調節(jié)細胞粘附[4-5]；它與肌營養(yǎng)不良蛋白和抗肌萎縮蛋白相關蛋白相互作用[4,6-8]，在細胞骨架維護中發(fā)揮作用；PGM5是細絲蛋白C、Xin-肌動蛋白結合重復蛋白B的結合伙伴，細絲蛋白C與PGM5的N端結合，而Xin-肌動蛋白結合重復蛋白B與PGM5的C端相互作用，二者競爭結合，參與肌原纖維的形成、維持和重塑[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)它的染色體融合位點離端粒位置很近，可能會影響端粒的功能[10-11]。對PGM5在腫瘤中的表達及作用的研究較少，近年才有研究發(fā)現(xiàn)PGM5與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。對腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫的臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)，PGM5在肝癌[12]、結直腸癌[13]中表達下調，與患者預后不良有關；PGM5抑制結直腸癌的生長、遷移和侵襲[13]。但PGM5在肝癌細胞系中的生物學功能未見報道。本研究中，我們擬構建人PGM5基因的真核表達載體，探討PGM5對肝癌細胞生長、遷移的影響，為進一步研究PGM5在癌癥發(fā)生發(fā)展中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞、肝癌HepG2細胞、pcDNA3.0-Flag載體、人乳腺文庫（本實驗室保存）；限制性內切酶、PCR試劑、DNA連接酶（TaKaRa公司）；質粒提取試劑盒（Promega公司）；膠回收和PCR回收試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）；轉染試劑VigoFect（威格拉斯生物技術有限公司）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司）；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的Flag抗體（Sigma公司），辣根過氧化物酶偶聯(lián)的β-actin（SantaCruz公司）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購買、引物合成及質粒測序（北京博邁德生物技術有限責任公司）。

1.2 pcDNA3.0-Flag-PGM5重組質粒的構建

根據NCBI網站PGM5的編碼序列設計并合成上游引物（5'-GGGGTACCATGGAGGGGAGCCC CATCCCGGTGCT-3'）和下游引物（5'-GCTCTAGA TCAGGTGATGACAGTGGGTCCCCTCCGG-3'），上、下游引物5'端分別攜帶KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點。以人乳腺文庫為模板擴增PGM5基因（95℃預變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)，72℃再延伸 5 min），PCR產物用膠回收試劑盒回收，回收的PCR產物和載體pcDNA3.0-Flag分別經KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切，4 h后回收酶切目的片段和載體，將二者用T4DNA連接酶于16℃連接4 h，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐西林的LB瓊脂板，培養(yǎng)16 h后挑取部分菌落進行菌液PCR，選取陽性克隆菌液轉入含氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h，提取質粒，雙酶切鑒定，陽性克隆送公司測序。

1.3 轉染293T細胞

接種適量293T細胞于6孔板中，至轉染時細胞密度40%～60%為宜，培養(yǎng)24 h，轉染時提前1 h換液。按照VigoFect轉染試劑說明，將空載體和pcDNA3.0-Flag-PGM5質粒分別轉染293T細胞。取總量 4 μg的質粒加入 NaCl補足至 100 μL 混勻，再將 2 μL VigoFect試劑與 98 μL NaCl混勻，分別靜置5 min，將兩者混合制成轉染工作液，室溫靜置15 min，加入293T細胞中，輕輕混勻培養(yǎng)液，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h后換液，24 h后收取細胞。

1.4 Western印跡

收集細胞沉淀，加入等量細胞裂解液混勻，冰上裂解30 min，再加入等量2×SDS上樣緩沖液，沸水煮樣15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE，電泳結束后，電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶3000稀釋的Flag-HRP和β-actin-HRP抗體，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，化學發(fā)光法顯色45 s，壓片顯影。

1.5 CCK8細胞生長曲線

將空載體和pcDNA3.0-Flag-PGM5分別轉染HepG2細胞，培養(yǎng) 24 h后，將細胞以3×103/孔的密度接種于96孔板，每組設3個平行孔。每天同一時間點向各孔加入含10%CCK8試劑的DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)1 h，取出后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定D450nm值。

1.6 細胞劃痕實驗

接種細胞于6孔板，將空載體和pcDNA3.0-Flag-PGM5分別轉染HepG2細胞，培養(yǎng)24 h后，每組用小槍頭在融合的單層細胞上劃3條直線，PBS洗細胞3次，去除死細胞，換成新鮮的低血清培養(yǎng)基，在劃痕處分別選上、中、下三點在顯微鏡下拍照，記錄初始位置，24 h后在初始位置再次拍照。用ImageJ軟件計算劃痕愈合面積。

1.7 數據分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。2組之間數據比較采用非配對獨立t檢驗，不同時間點PGM5對肝癌細胞生長的影響用重復測量資料方差分析（ANOVA）。所有實驗均獨立重復3次，數據以x±s表示，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pcDNA3.0-Flag-PGM5過表達載體的構建與鑒定

以人乳腺文庫為模板擴增PGM5基因，獲得約1704 bp的目的片段（圖1），與預期大小一致。目的片段酶切后插入pcDNA3.0-Flag載體，構成重組質粒。選取2個菌液PCR鑒定為陽性的克隆，提取質粒進行雙酶切鑒定，在1500～2000 bp處可見特異性條帶，而空載體則無此條帶，初步證明其為陽性克?。▓D2A）。將酶切鑒定的陽性克隆測序，測序結果表明插入片段序列與人PGM5基因的編碼序列相同（圖2B，顯示部分測序結果）。

2.2 驗證pcDNA3.0-Flag-PGM5介導的PGM5的表達

分別將空載體和pcDNA3.0-Flag-PGM5質粒轉染293T細胞，24 h后收取細胞蛋白，Western印跡檢測其表達情況。結果顯示，過表達組在相對分子質量60×103的位置可見特異性條帶，而對照組則沒有此條帶，表明pcDNA3.0-Flag-PGM5能在細胞中介導PGM5表達（圖3）。

2.3 pcDNA3.0-Flag-PGM5對肝癌細胞生長的影響

圖1 PCR擴增PGM5的編碼序列

圖2 pcDNA3.0-Flag-PGM5質粒鑒定

為了探究PGM5對肝癌細胞生長的影響，分別將空載體和pcDNA3.0-Flag-PGM5質粒轉染HepG2細胞，培養(yǎng)24 h后收取一部分細胞進行Western印跡，檢測PGM5的表達；另一部分細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，連續(xù)6 d于同一時間用CCK8試劑盒檢測PGM5表達對細胞生長的影響。結果見圖4，與對照組相比，PGM5過表達十分顯著地抑制了HepG2細胞的生長。

2.4 pcDNA3.0-Flag-PGM5對肝癌細胞遷移的影響

采用細胞劃痕實驗研究PGM5對肝癌細胞遷移的影響，設置對照組、PGM5過量表達組，劃痕24 h后測量遷移面積。由圖5可知，在HepG2細胞中，與對照組相比，PGM5過表達組劃痕愈合面積明顯較小，表明PGM5抑制了肝癌細胞的遷移。

圖3 pcDNA3.0-Flag-PGM5表達鑒定

圖4 PGM5對肝癌細胞生長的影響

3 討論

最初對于PGM5的研究主要集中于其在肌肉組織中的作用。PGM5在肌膜和肌腱交界處集中表達，參與肌原纖維的形成、維持和轉換[4,9]，PGM5是肌營養(yǎng)不良蛋白的結合伙伴，它與肌營養(yǎng)不良蛋白的N端和C端結合[7]，在細胞黏附連接和細胞骨架維護中發(fā)揮作用[6,14]。隨著對腫瘤研究的逐漸深入，研究者才逐步發(fā)現(xiàn)PGM5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)透明細胞腎細胞癌中PGM5反義RNA1（PGM5-AS1）表達下調[15]。有學者對TCGA數據庫的肝癌臨床樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中PGM5表達低于癌旁正常肝組織，與晚期組織學類型、組織學分級、分期、T分級密切相關[12]，且與生存率和總生存期呈正相關[12-13]，表明PGM5可以作為一個獨立的預后因素。在功能上，PGM5的上調可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而PGM5的下調則發(fā)揮相反的作用[13]，提示PGM5是結直腸癌新的腫瘤抑制因子。但PGM5對肝癌細胞生物學功能的影響未見報道，因此我們進一步探究了PGM5對肝癌細胞生長、遷移功能的影響。我們的研究表明，PGM5上調可抑制肝癌細胞的增殖和遷移，提示其是肝癌細胞新的腫瘤抑制因子，與TCGA肝癌臨床意義分析結果一致。

圖5 PGM5對肝癌細胞遷移的影響

綜上所述，我們構建了PGM5表達載體，并發(fā)現(xiàn)PGM5具有作為肝癌診斷和預后生物標志物的潛力，同時提示其可能在某些腫瘤中扮演腫瘤抑制因子的作用，為進一步研究其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移機制等方面的作用提供了理論基礎。