HPV16 E786-93納米顆粒疫苗的免疫殺傷效果研究

胡張可，鄧雄威，趙佳琦，韓盧，石思偉，董曉筱，肖向茜，盛望

1.北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.國家納米科學中心，北京 100190

宮頸癌是全球第三大常見的癌癥[1-2]。由人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）引起。在所有子宮頸癌病例中，超過80%發(fā)生在發(fā)展中國家[3]。我國癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，2014年全國宮頸癌新發(fā)病例10.2萬，死亡3.0萬例[4]。雖然預(yù)防性HPV疫苗在全球范圍內(nèi)得到推廣并獲得一定成效，但對于已感染人群沒有保護效果，傳統(tǒng)手術(shù)和放化療只能去除病變組織，不能清除病毒，存在一定的復發(fā)風險，且暫無治療性HPV疫苗上市[5-6]。在已鑒定出的200多種HPV亞型中，以HPV16型感染與宮頸鱗癌的關(guān)系最為密切。HPV陽性細胞可表達2種對誘導和維持細胞轉(zhuǎn)化至關(guān)重要的病毒癌蛋白E6和E7，E6和E7在癌前病變和晚期病變中均有組成性表達，使其成為HPV誘導的惡性腫瘤免疫治療的理想靶標。HPV癌蛋白E6和E7已廣泛用于早期治療性HPV疫苗研究中，通過激活細胞免疫應(yīng)答達到清除受病毒感染細胞的目的。目前治療性HPV疫苗多以E7作為靶抗原，這是因為其表達量及保守性較高[7]。E7蛋白可以與Rb蛋白結(jié)合使后者磷酸化而與E2F解離，失去對E2F轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而導致細胞分裂增殖失調(diào)，轉(zhuǎn)化為永生化細胞[8]。目前，已有一些以HPV16 E6、E7為靶抗原的小鼠或人的T 細胞表位被鑒定出來，如 E711-20、E749-57、E786-93等CTL 表位[9-10]，E735-50、E743-77、E750-62、E748-54等 Th 表位，以及兼有CTL表位和Th表位的E643-57[11-12]。

近年來，納米技術(shù)的出現(xiàn)，為腫瘤疫苗不能引起機體產(chǎn)生較強烈的特異性免疫反應(yīng)、生物利用度不高等問題提供了新的解決思路。利用納米技術(shù)制備抗腫瘤疫苗成為有效激發(fā)體內(nèi)特異性免疫反應(yīng)的新方法。Tang等構(gòu)建了HIV-1 Tat49-57/HPV16 E749-57融合肽和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）DNA的自組裝納米疫苗，在小鼠中引起強效且持續(xù)的CTL依賴性抗腫瘤免疫[13]。Rad-Malekshah等[14]通過將自組裝肽片段Ac-AAVVLLLW-COOH添加到HPV E743-57N端形成融合肽納米顆粒，并與免疫佐劑CpG-ODN聯(lián)用，以增強肽抗原HPV E743-57的免疫原性，結(jié)果表明納米顆粒疫苗能夠有效誘導強烈的CTL細胞毒性反應(yīng)，并顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，延長了生存期。此類研究表明，納米顆粒中的抗原肽能夠誘導比其在非納米形式下更強的免疫反應(yīng)，使兩者能夠作用于同一抗原遞呈細胞，更好地發(fā)揮協(xié)同作用，實現(xiàn)腫瘤疫苗和免疫增強劑的共傳遞。同時，也可保護抗原不被機體快速降解和清除，有效延長抗原在體內(nèi)的作用時間，提高抗原的攝取和遞呈效率，增強疫苗的免疫效應(yīng)。CpG-ODN被認為是一種理想的免疫佐劑，可誘導機體產(chǎn)生腫瘤特異性或病毒特異性免疫反應(yīng)，激活B細胞和漿細胞樣樹突狀細胞，誘導細胞因子的產(chǎn)生和抗原呈遞細胞的成熟[15-16]。但其在體內(nèi)易被酶類降解，穩(wěn)定性有待提高。隨著納米技術(shù)研究的逐漸深入，為小核酸藥物的體內(nèi)遞送提供了新的思路。

在本研究中，我們采用HPV16 E7蛋白CTL表位中與MHC-Ⅰ分子親和力高又具有較強抗原性的優(yōu)勢表位E786-93，將序列為TLGIVCPI的抗原表位肽連接在在富含正電荷的多聚賴氨酸（Poly K10）末端，通過靜電引力與帶負電荷的CpGODN自組裝成納米顆粒疫苗，探討其抗腫瘤和體外刺激樹突狀細胞（DC）分泌細胞因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雌性C57BL/6N小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于PONY測試集團SPF級動物房［SYXK（京）2018-0022］；TC-1細胞（轉(zhuǎn)染ras基因和HPV16E6、E7基因的C57BL/6小鼠肺上皮細胞）由本實驗室保存；CpG1826由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；添加親水序列的HPV16 E786-93表位肽（序列：KKKKKKKKKKTLGI VCPI，純度≥95%）由南京源肽生物科技有限公司合成；GM-CSF、IL-4購自Peprotech公司；小鼠IL-6、IL-12p40 ELISA 試劑盒，鼠 CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE單克隆抗體均購自BioLegend公司；胎牛血清（FBS）、PBS（pH7.4）、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素、DNA酶購自索萊寶公司；膠原酶Ⅴ購自Sigma Aldrich公司；小鼠淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術(shù)有限公司。

1.2 納米顆粒的制備

用去離子水制備400 μg/mL的CpG-ODN溶液和1 mg/mL的HPV16 E786-93溶液，將CpG-ODN溶液逐滴滴加到等體積的HPV16 E786-93溶液中并不斷攪拌，室溫孵育30 min后于4℃、15 000 r/min離心30 min分離納米顆粒，棄上清液，用去離子水復溶沉淀，即得到CpG/E786-93納米顆粒。

1.3 CpG包載效率測定

采用熒光強度-濃度法測定納米顆粒中包載CpG-ODN的含量，本實驗使用Cy-3熒光標記的CpG-ODN（Cy-3-CpG）。分別通過Cy-3-CpG的熒光強度和濃度制作相應(yīng)的標準曲線，計算出納米顆粒包載后上清液中的CpG-ODN質(zhì)量，通過與初始投料質(zhì)量相比，計算包載效率。

1.4 納米顆粒的表面形態(tài)及粒徑大小

取納米顆粒溶液滴于銅網(wǎng)上，以磷鎢酸負染色法拍攝透射電鏡照片，觀察其形態(tài)。采用激光粒度儀測定納米粒子水合粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity，PDI）和表面ζ電位，每項測量3次，取平均值。

1.5 小鼠免疫方案

取對數(shù)生長期的小鼠肺上皮細胞TC-1加入RPMI-1640配制成濃度為5×106/mL的細胞懸液，以0.1 mL接種于C57BL/6N小鼠右側(cè)腹皮下，待接種后6 d腫瘤生長至2～3 mm時隨機分為PBS組、CpG組、E786-93組、CpG/E786-93組、納米顆粒疫苗（Nano）組，每組5只。給藥方式見表1，共給藥3次，每次給藥間隔1周，最后一次給藥后1周處死小鼠，取腫瘤、外周血及脾臟。每隔2 d用游標卡尺測量腫瘤直徑，并記錄體重變化，觀察實驗小鼠抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤體積=1/2×a×b2，其中a、b分別表示腫瘤的長和寬。

表1 小鼠免疫組給藥方案

1.6 細胞表面抗原染色與流式細胞分析

第3次免疫后1周將小鼠麻醉，眼眶取血至EDTA抗凝管中，4000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL PBS稀釋，用滴管將稀釋后的血液沿試管壁緩慢加入含有2 mL淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，并與分離液形成明顯界面，1500 r/min離心15 min，吸出中層呈白絮狀的淋巴細胞，PBS潤洗2次。

將分離的腫瘤組織切成小塊，轉(zhuǎn)移到含有RPMI-1640、膠原酶Ⅴ（41.75 μg/mL）和 DNA 酶（2 μg/mL）的培養(yǎng)皿中，37℃孵育30 min，于細胞篩網(wǎng)中研磨組織并用PBS沖洗，收集細胞懸液，重懸在淋巴細胞分離液中。分離的淋巴細胞在染色前用PBS潤洗2次。

取出脾臟，放入預(yù)先加入4 mL淋巴細胞分離液的平皿中，將細胞篩網(wǎng)置于平皿上進行組織研磨，收集細胞懸液，緩慢加入1 mL RIPM-1640，水平離心30 min，取淋巴細胞層溶液，PBS潤洗2次后進行流式染色。

用CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE熒光抗體進行淋巴細胞染色，BD-FACS流式細胞儀分析。

1.7 體外骨髓來源樹突狀細胞（BMDC）分離及誘導培養(yǎng)

取小鼠脛骨和股骨，用RPMI-1640沖洗骨髓，收集細胞，37℃靜置30 min，收集非貼壁細胞及輕微貼壁細胞，1000 r/min離心5 min，按5×106/mL的濃度鋪6孔板，RPMI-1640培養(yǎng)基中加入20 ng/mL GM-CSF和 1 ng/mL IL-4培養(yǎng) 7 d，第3、5 d更換培養(yǎng)基，補充血清及細胞因子，第7 d收集懸浮細胞，在含20 ng/mL GM-CSF、1 ng/mL IL-4的培養(yǎng)基中以1×106/mL的濃度鋪板，分別加入 PBS、E786-93（10 μg/mL）、CpG（4 μg/mL）、CpG/E786-93（CpG 4 μg/mL，E786-9310 μg/mL）、Nano（CpG 4 μg/mL，E786-9310 μg/mL），培養(yǎng) 24 h。

1.8 ELISA檢測BMDC培養(yǎng)液中IL-6和IL-12p40水平

收集各組BMDC的培養(yǎng)上清液，于-80℃儲存。根據(jù)標準品濃度和所測得標準品的吸光度值繪制標準曲線，將樣品稀釋到合適濃度，用ELISA試劑盒分別測定IL-6、IL-12p40的D450nm值,計算各細胞因子的含量，每組設(shè)3個復孔。

1.9 統(tǒng)計分析

流式細胞結(jié)果用FlowJo軟件分析，用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用GraphPad Prism 8.0軟件繪制圖表。組間比較采用方差分析和t檢驗，所有分析中差異的顯著性表示為*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒的物理表征

E786-93表位肽的氨基基團帶有正電荷，CpGODN帶負電荷，借助正負電荷間的相互作用使二者在水溶液中相互作用，制備得到CpG/E786-93納米顆粒（圖1）。通過激光粒度儀測定納米顆粒的物理性質(zhì)，可知納米顆粒的水合粒徑為206±5.1 nm（圖 2），PDI為 0.123±0.1，表面ζ電位為 15.6±2.2 mV，CpG-ODN的包載效率達到91.5%。

2.2 納米顆粒疫苗對小鼠TC-1細胞的抑制作用

以C57BL/6N小鼠為模型，皮下成瘤進行體內(nèi)治療性實驗。圖3A顯示Nano組小鼠的腫瘤體積顯著低于其他各組，該組平均腫瘤大小僅為CpG/E786-93組的39%。圖3B為小鼠個體腫瘤生長曲線，Nano組內(nèi)5只小鼠的腫瘤體積增長個體差異小，其他組內(nèi)存在很大的個體差異。

圖1 CpG/E786-93納米顆粒的透射電鏡照片

圖2 CpG/E786-93納米顆粒的粒徑分布

圖3 體內(nèi)腫瘤治療性效果研究

2.3 小鼠瘤內(nèi)浸潤性T淋巴細胞百分比

處死小鼠后將分離的腫瘤組織切成小塊，在細胞篩網(wǎng)中研磨組織，收集的細胞重懸于淋巴細胞分離液中，表面染色后用流式細胞儀分析腫瘤組織內(nèi)浸潤性T淋巴細胞含量。由圖4可見，CpG/E786-93組與Nano組相比于對照組都有較為明顯的上升。與注射CpG/E786-93相比，Nano組小鼠瘤內(nèi)浸潤性T淋巴細胞比例較高并具有顯著性差異（*P＜0.05）

2.4 小鼠脾臟內(nèi)T淋巴細胞百分比

取出小鼠脾臟置于平皿中，加入淋巴細胞分離液進行組織研磨，收集細胞懸液離心，取中間部位的淋巴細胞層溶液進行流式染色。由圖5可知，Nano組小鼠脾臟內(nèi)T淋巴細胞相比于對照組有較為明顯的升高。與CpG/E786-93組相比，Nano組小鼠脾臟內(nèi)T淋巴細胞百分比較高并具有顯著性差異（*P＜0.05）

2.5 小鼠外周血T淋巴細胞百分比

麻醉小鼠后眼眶取血置于抗凝管中，將稀釋后的血液緩慢加入含有淋巴細胞分離液的離心管中，并與分離液形成明顯界面，離心后吸出中層呈白絮狀的淋巴細胞，進行染色。由圖6可知，與對照組相比，CpG/E786-93組與Nano組T淋巴細胞百分比均有明顯提升，但是2組之間不具有統(tǒng)計學上的顯著性。

圖4 小鼠瘤內(nèi)浸潤性CD4+（A）和CD8+（B）T淋巴細胞百分比

2.6 ELISA檢測BMDC培養(yǎng)上清中IL-6和IL-12p40濃度

圖5 小鼠脾臟內(nèi)浸潤性CD4+（A）和CD8+（B）T淋巴細胞百分比

圖6 小鼠外周血CD4+（A）和CD8+（B）T淋巴細胞百分比

取小鼠脛骨和股骨沖洗骨髓，收集非貼壁細胞培養(yǎng)7 d，加入不同刺激物培養(yǎng)24 h，用ELISA試劑盒測定BMDC培養(yǎng)上清中IL-6和IL-12p40的濃度。由圖7A可知，與對照組相比，CpG組、CpG/E786-93組及Nano組培養(yǎng)上清中的IL-6濃度均明顯上升，其中Nano組與CpG/E786-93組相比具有顯著性差異（***P＜0.001）。據(jù)圖7B可以看出，CpG組、CpG/E786-93組及Nano組與對照組刺激后的BMDC培養(yǎng)上清分泌的IL-12p40相比有明顯提升，Nano組與CpG/E786-93組相比具有顯著性差異（*P＜0.05），說明納米顆粒疫苗對于成熟BMDC分泌促炎性細胞因子IL-6、IL-12p40具有明顯的刺激作用。

3 討論

腫瘤肽疫苗能夠直接刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，且不會引起自身免疫反應(yīng)或免疫抑制，應(yīng)用前景廣闊。與傳統(tǒng)疫苗相比，腫瘤表位肽疫苗具有更高的臨床安全性，設(shè)計簡單，易于大量合成制備，可與佐劑聯(lián)用，誘導較強的CD8+T細胞反應(yīng)，彌補單獨使用肽疫苗的不足[17]。在針對早期宮頸癌的Ⅱ期臨床試驗中，以E711-22及E786-93短肽結(jié)合通用Th表位PADRE的疫苗對12個病人中的4位誘導產(chǎn)生了肽特異性的免疫應(yīng)答，表明基于CTL表位的肽疫苗對于治療HPV16引起的早期宮頸疾病是有效的[18]。近年來隨著納米技術(shù)的發(fā)展以及新型納米材料的開發(fā)應(yīng)用，多肽免疫治療與納米技術(shù)相結(jié)合的納米疫苗策略顯現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢，納米顆粒可以對包裹其中的抗原起到有效保護作用，可防止其在體內(nèi)新陳代謝過程中過早分解，延長抗原在體內(nèi)的滯留時間，利于提高免疫效應(yīng)，且納米疫苗粒徑較小，具有淋巴靶向性。

圖7 BMDC經(jīng)體外刺激后IL-6（A）和IL-12p40（B）的表達分析

我們以HPV16 E7限制性CTL表位E786-93為模式表位，與免疫佐劑CpG-ODN通過靜電引力作用自組裝成納米顆粒疫苗，通過直接注射經(jīng)過篩選的CTL抗原表位肽，使抗原肽能夠被DC攝取并呈遞給相應(yīng)的MHC-Ⅰ類分子，誘導CD8+T淋巴細胞增殖、活化。流式檢測脾臟、瘤內(nèi)浸潤性T淋巴細胞結(jié)果顯示，納米顆粒疫苗相對非納米組有顯著性升高，而在血液中兩者差異雖不具有顯著性，但相比對照組均明顯上升；CpG作為佐劑，可通過與B淋巴細胞、DC等細胞表面的模式識別受體結(jié)合，激活下游MAPK和NF-κB等信號通路，促使細胞分泌各種細胞因子。ELISA檢測體外培養(yǎng)DC上清顯示，Nano組可顯著增加促炎性細胞因子IL-6、IL-12的分泌，誘導并增強炎癥反應(yīng)，IL-6可以促進B淋巴細胞分化和分泌抗體，增強NK細胞對靶細胞的殺傷，從而間接增強T淋巴細胞的抗腫瘤能力，而IL-12可以促進T淋巴細胞分泌IFN-γ，誘導Th0向Th1細胞的分化。在腫瘤抑制方面，雖然納米顆粒疫苗組平均腫瘤體積與CpG/E786-93組相比不具有顯著性差異，但個體生長曲線顯示納米顆粒疫苗組對小鼠腫瘤體積抑制效果比較穩(wěn)定，組內(nèi)小鼠的腫瘤體積較為平均，而非納米化直接給藥的生物利用率有高有低，可能是因為未經(jīng)修飾的CpG-ODN易被血清中的DNA酶降解，而納米顆粒通過對CpGODN的包載，使其能在體內(nèi)環(huán)境中保持穩(wěn)定，以及單獨注射E786-93表位肽不能有效被抗原提呈細胞提呈等原因。

綜上所述，納米顆粒疫苗可以有效且穩(wěn)定地抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，改善腫瘤微環(huán)境，且與CpG/E786-93組相比生物利用率更高，無藥物注射后的副反應(yīng)。由于傳統(tǒng)的免疫佐劑具有一定的毒副作用，以納米為基礎(chǔ)的疫苗在安全性上要優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫佐劑輔佐免疫的方法。后續(xù)將著力于探究納米顆粒疫苗的免疫效果與肽段及佐劑的選擇、疫苗的劑量及免疫方法等因素的關(guān)系，以及能否通過聯(lián)合體液、細胞免疫雙途徑等方式來提高腫瘤抑制效果，為基于納米技術(shù)的免疫治療方法提供新思路。