檸檬酸對紫色紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K能力的影響

李穎慧,朱倩倩,焦 梓,石嘉辰,張 函,王成濤,2,張 嬋,2,*

(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué),北京 100048)

紅曲菌是一種絲狀真菌,屬真子囊菌綱(Euascomycetes),散子囊菌目(Eurotiales),紅曲菌科(Monascaceae),紅曲菌屬(MonascusvanTieghem)[1]。我國對紅曲菌的應(yīng)用歷史悠久,紅曲起源于中國,自唐代起就用于食品加工中,在我國的生產(chǎn)和應(yīng)用已經(jīng)有1000多年的歷史,在大米上接種紅曲菌,并經(jīng)過發(fā)酵而制得紅曲米[2]。紅曲菌次級代謝產(chǎn)物繁多,包括Monacolin K[3]、紅曲色素[4-5]、γ-氨基丁酸[6-9]、麥角固醇[10]、桔霉素等[11-13],而Monacolin K和紅曲色素是目前應(yīng)用最廣泛的次級代謝產(chǎn)物[14-15]。1979年,日本的遠(yuǎn)藤章教授從紅色紅曲菌(Monascusruber)的發(fā)酵液中分離出一種能夠強(qiáng)力抑制膽固醇合成的活性物質(zhì),并將其命名為Monacolin K。現(xiàn)代研究表明,Monacolin K競爭性抑制膽固醇合成通路中的限速酶HMG-CoA還原酶,具有顯著的降膽固醇功效,是目前醫(yī)藥界公認(rèn)的降低膽固醇的理想藥物之一,因此引起科研工作者的深入研究[16]。紅曲色素作為天然優(yōu)質(zhì)食用色素,有抗突變、防腐等作用,在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用較廣,具有廣闊的市場前景[17-18]。

目前,我國工業(yè)化生產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K均存在成本高、產(chǎn)量低等問題,因此提高紅曲菌菌株發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的能力具有重要的現(xiàn)實意義[16]。近年來,出現(xiàn)了許多促進(jìn)紅曲菌次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)的策略,包括誘變育種、優(yōu)化發(fā)酵條件、構(gòu)建工程菌株等。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸可提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量,其中谷氨酸能使Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到對照組的3.5倍。朱蕊等[20]發(fā)現(xiàn)酵母的代謝產(chǎn)物對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀(Monacolin K)有一定影響,釀酒酵母對洛伐他汀產(chǎn)量提高最為明顯,相比未共發(fā)酵條件下的洛伐他汀產(chǎn)量提高了34.5%。常聰?shù)萚21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫外誘變、氯化鋰化學(xué)誘變及紫外-氯化鋰復(fù)合誘變,可獲取能穩(wěn)定高產(chǎn)Monacolin K或紅曲色素的紅曲菌株。本實驗通過前期分析[19],推測在添加谷氨酸后,抑制了檸檬酸循環(huán)的代謝,從而使乙酰輔酶A更多的用于合成 Monacolin K。有文獻(xiàn)報道,在紅曲菌發(fā)酵過程中添加TCA循環(huán)中關(guān)鍵中間產(chǎn)物檸檬酸也會提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量[22]。因此,本實驗進(jìn)一步來探究檸檬酸類物質(zhì)促進(jìn)紅曲菌對紫色紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K能力的影響。在培養(yǎng)菌株的過程中加入3個不同濃度梯度:0.05%、0.1%、0.2%的檸檬酸,分別取第5、8、12、15 d發(fā)酵液作為樣品,通過紫外分光光度計對樣品色價、高效液相色譜對Monacolin K產(chǎn)量、菌體干重生物量的測定和熒光定量PCR對Monacolin K合成關(guān)鍵基因的分析,探究檸檬酸類物質(zhì)的添加對于紅曲菌菌體、次級代謝產(chǎn)物和關(guān)鍵基因的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)量穩(wěn)定的紫色紅曲菌菌株(Monascuspurpureus)M1 本實驗室保存;RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;PDA、葡萄糖、豆粕粉、甘油、蛋白胨、KH2PO4、NaNO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、50×TBE、DEPC 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

20A型高效液相色譜儀 日本島津公司;CFX96 實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司;SW-CJ-IFD 清潔工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZWP-A1230恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器有限公司;ZDC100C通風(fēng)柜 北京航天科恩實驗室裝備科學(xué)技術(shù)有限公司;RF-20Axs 熒光檢測器 日本島津公司;LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HZQ-F160 型全溫震蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;FM50 雪花制冰機(jī) 北京長流科學(xué)儀器公司;BSA224S 型數(shù)字電子天平 Sartorius 公司;SU8010掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)[23]:PDA37 g,瓊脂7.5 g。

普通液體種子培養(yǎng)基(g/L)[23]:葡萄糖30 g,甘油70 g,豆粕粉15 g,蛋白胨10 g,KH2PO42 g,NaNO32 g,MgSO4·7H2O 1 g。

普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[23](空白對照組):甘油90 g,大米粉20 g,蛋白胨10 g,KH2PO42.5 g,NaNO35 g,MgSO4·7H2O 1 g,ZnSO4·7H2O 2 g。

0.05%檸檬酸-發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油90 g,大米粉20 g,蛋白胨10 g,KH2PO42.5 g,NaNO35 g,MgSO4·7H2O 1 g,ZnSO4·7H2O 2 g,檸檬酸0.5 g。

0.10%檸檬酸-發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油90 g,大米粉20 g,蛋白胨10 g,KH2PO42.5 g,NaNO35 g,MgSO4·7H2O 1 g,ZnSO4·7H2O 2 g,檸檬酸1.0 g。

0.20%檸檬酸-發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油90 g,大米粉20 g,蛋白胨10 g,KH2PO42.5 g,NaNO35 g,MgSO7·H2O 1 g,ZnSO4·7H2O 2 g,檸檬酸2.0 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng) 將紅曲菌M1菌株在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),并在M1的基礎(chǔ)上活化2代,每代約2～3 d后,將活化好的菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中,以30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至種子液培養(yǎng)基呈淺粉色,約需48 h,將紅曲菌種子液以10%的接種量接種于50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),并以30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h,后將溫度改為25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至第15 d。

1.3.2 檸檬酸最適濃度的摸索 發(fā)酵培養(yǎng)第3 d,分別向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入四個濃度:0.1%、0.5%、1%、2%的檸檬酸溶液。收集紅曲菌第12 d發(fā)酵液置于2 mL離心管中,測定在這四個濃度下Moncolin K的產(chǎn)值,并進(jìn)一步細(xì)分化檸檬酸的濃度。

1.3.3 檸檬酸最適添加濃度的確定 活化步驟同上,在發(fā)酵培養(yǎng)第3 d向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.05%、0.1%、0.2%的檸檬酸。分別收集紅曲菌第5、8、12、15 d發(fā)酵液置于2 mL離心管中,12000 r/min離心10 min,棄去上清液,用滅過菌的超純水重懸,反復(fù)四次,用槍頭吸除離心管中剩余水分(此步水分需全部吸除干凈)后,置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.4 Monacolin K含量、紅曲色素色價及生物量的測定

1.3.4.1 Monacolin K的檢測 先進(jìn)行發(fā)酵液的預(yù)處理,取5 mL發(fā)酵液,加入15 mL的75%甲醇,超聲波萃取30 min,靜置(避光),取其中的上清液,用0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾,檢測濾液中Monacolin K含量。然后采用HPLC法,HPLC檢測條件:色譜柱:InertsilODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm),流動相:0.1%磷酸∶甲醇=1∶3,流速:1 mL/min,檢測器:紫外檢測器(PDA),檢測波長:237 nm,檢測溫度:30 ℃,進(jìn)樣量:10 μL[24]。

1.3.4.2 色價的測定 紅曲色素常規(guī)提取工藝及色價測定采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB4926-2008。根據(jù)紅曲復(fù)合色素在505、448、410 nm有吸收主峰的特征,測定發(fā)酵液經(jīng)離心的上清稀釋液在505、448、410 nm處的吸光度,以70%乙醇溶液為空白對照[25],計算其總色價。

總色價=稀釋倍數(shù)×吸光度/發(fā)酵液體積(mL)

1.3.4.3 生物量檢測 使用三層紗布,反復(fù)洗滌,用烘箱烘干至恒重,取5 mL紅曲菌發(fā)酵液用紗布過濾,再用蒸餾水沖洗菌液至滴下的濾液不在呈現(xiàn)紅色,擰干水分,在60 ℃烘箱中烘干至恒重,稱量減去紗布的重量即為5 mL紅曲菌發(fā)酵液中紅曲霉菌絲體干重[26]。

生物量(g/L)=干物質(zhì)質(zhì)量(g)/發(fā)酵液體積(L)

1.3.5 菌絲體超微結(jié)構(gòu)觀察 在25 ℃溫度下,將M1菌絲體固定在25%戊二醛溶液中,在磷酸鹽緩沖液(PBS)中固定12h。在pH7.2的PBS中用0.1 mol/L H3PO4溶液沖洗菌絲體細(xì)胞懸液,離心(12000 r/min,5 min,4 ℃)。棄上清液,分別用乙醇(30%、50%、70%、80%、90%和100%)進(jìn)行梯度洗脫,懸浮、脫水、離心(12000 r/min,5 min)獲得菌絲體。用乙酸異戊酯-乙醇溶液(1∶1,v∶v)去除乙醇,靜置10 min,12000 r/min離心5 min,棄上清液。采用適量的六甲基二硅氮烷(HMDS)對菌絲體進(jìn)行再懸浮,離心時棉花堵塞管上部,在60 ℃時將樣品干燥成粉末,初步固定后用金鈀包覆2 min。然后用SU8010掃描電子顯微鏡獲取顯微照片。

1.3.6 Monacolin K合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄量分析

1.3.6.1 熒光定量PCR引物設(shè)計 用Beacon Designer 8.0軟件,根據(jù)NCBI網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/DQ176595.1)上的紅曲菌Monacolin K 合成相關(guān)基因序列信息,選取mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH、mokI以及LaeA十段基因組序列為模板,以GAPDH基因為內(nèi)參基因,按照實時熒光定量PCR(Reverse Transcription-quantitative real-time polymerasechain reaction,RT-qPCR)的要求設(shè)計特異性引物,引物序列見表1。

表1 紅曲菌MonacolinK合成相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR引物Table 1 Target genes and primers of Monacolin K in M.purpureus

1.3.6.2 實時熒光定量PCR分析 分別取原始培養(yǎng)基和添加0.1%檸檬酸培養(yǎng)基的紫色紅曲菌發(fā)酵菌液2 mL,用超純水洗滌4次后,提取菌絲體RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用RT-qPCR法測定mokA-mokI和LaeA十段基因的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal熒光定量SYBR Green試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。RT-qPCR反應(yīng)體系:2×SuperReal Pre Mix Plus 10 μL;正向引物(10 μmol/L)0.6 μL;反向引物(10 μmol/L)0.6 μL;cDNA模板1 μL;RNase-free ddH2O至20 μL。采用三步法PCR程序反應(yīng),熒光定量PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性4 min,然后35個循環(huán),每個循環(huán)包括94 ℃ 變性30 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗操作重復(fù)三次,采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)計算,Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸最適濃度的探索

從圖1中可知,當(dāng)添加檸檬酸濃度為0.1%時,Monacolin K的產(chǎn)量是最高的,達(dá)到了原始培養(yǎng)基的2.36倍,有顯著的促進(jìn)效果(P<0.05);當(dāng)檸檬酸濃度為0.5%時,Monacolin K的產(chǎn)量是原始培養(yǎng)基的1.23倍,促進(jìn)效果不顯著;而當(dāng)檸檬酸濃度過大,達(dá)到1%和2%時,Monacolin K的產(chǎn)量分別為原始培養(yǎng)基的76.2%和18.1%,抑制了Monacolin K的產(chǎn)生。因此,下文對檸酸濃度為0.05%、0.1%、0.2%的三個濃度進(jìn)行考察,從而探尋促使Monacolin K產(chǎn)量最大化的檸檬酸最適添加濃度。

圖1 檸檬酸濃度對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of citric acid concentrationon the production of Monacolin K.注:*代表與對照組相比差異顯著,P<0.05,**代表與對照組相比差異極顯著,P<0.01;圖2、圖3、圖6同。

從圖2中可以發(fā)現(xiàn),Monacolin K的產(chǎn)量隨著時間推移而增多,在第12 d達(dá)到最高積累量,而第15 d呈現(xiàn)下降趨勢。第12 d時分別添加三個濃度的檸檬酸都能對Monacolin K的產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用。添加0.05%、0.1%、0.2%三個濃度檸檬酸所產(chǎn)生的Monacolin K產(chǎn)量分別是原始培養(yǎng)基產(chǎn)生Monacolin K量的2.39倍、2.71倍、2.54倍,通過上述檢測結(jié)果可以確定,添加濃度在0.1%的檸檬酸可以最大程度促進(jìn)Monacolin K的合成。

圖2 檸檬酸濃度對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of citric acid concentrationon the production of Monacolin K

2.3 紅曲色素色價檢測

由圖3可知,在12 d時,添加不同濃度檸檬酸后,紅曲紅色素、橙色素、黃色素色價明顯下降,說明檸檬酸對色素色價有著一定程度的影響,且都表現(xiàn)為抑制作用。紅曲色素與Monacolin K同屬聚酮體合成途徑,起始均由乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成丁酮,接下來便分為兩條代謝途徑,推測二者間存在競爭關(guān)系。柴詩緣等[16]通過培養(yǎng)基中添加谷氨酸對紅曲菌Monacolin K和紅曲色素的影響發(fā)現(xiàn),谷氨酸會增加Monacolin K的產(chǎn)量,但同時也降低了紅曲色素的產(chǎn)量,本研究的結(jié)果與其具有一致性。

圖3 發(fā)酵過程中檸檬酸濃度對紅曲色素色價的影響Fig.3 Effect of citric acid concentration on color value ofMonascus pigment during fermentation

2.4 生物量的檢測

通過比較添加檸檬酸培養(yǎng)基中的菌株和原始培養(yǎng)基中M1菌株在不同階段生物量的差異,研究檸檬酸對紅曲菌菌絲體生物量的影響,結(jié)果如圖4所示,在第2～8 d中生物量一直呈現(xiàn)下降趨勢,而第8 d之后出現(xiàn)明顯的增長直至第12 d。在添加檸檬酸培養(yǎng)基中的M1菌株和在原始培養(yǎng)基中的M1菌株菌絲體變化趨勢一致,且差異并不明顯。

圖4 不同濃度的檸檬酸對生物量的影響Fig.4 Effects of different concentrationsof citric acid on biomass

2.5 菌絲體超微結(jié)構(gòu)觀察

通過掃描電鏡對普通培養(yǎng)基和檸檬酸培養(yǎng)基中的紅曲菌菌絲體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察,掃描電鏡結(jié)果見圖5。與原培養(yǎng)基中的紅曲菌M1菌絲體相比,添加檸檬酸培養(yǎng)基中的紅曲菌菌絲體表面呈現(xiàn)出更多的褶皺,而原始培養(yǎng)基中的菌絲體相對飽滿。因此推測,檸檬酸可能是通過提高紅曲菌細(xì)胞膜通透性,將細(xì)胞合成的Monacolin K 及時分泌到細(xì)胞外,細(xì)胞質(zhì)中的Monacolin K濃度降低,進(jìn)而達(dá)到Monacolin K積累量增加的效果。

圖5 添加檸檬酸菌株與M1菌株在不同倍率下掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopic diagram ofcitric acid strain and M1 strain at different magnification注：A：M1菌株5000×；B：檸檬酸添加菌株5000×；C：M1菌株10000×；D：檸檬酸添加菌株10000×。

2.6 Monacolin K合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄量分析

對發(fā)酵過程中五個時間點(diǎn)的菌體RNA中十條基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析,分別是菌體前期生長的2 d,積累增長最快的對數(shù)期5 d,菌體進(jìn)入穩(wěn)定期的8 d,菌體積累量最高和合成Monacolin K速率最高的12 d,Monacolin K合成速率穩(wěn)定的15 d。

原始培養(yǎng)基與添加檸檬酸的培養(yǎng)基中,紅曲菌菌絲體Monacolin K合成相關(guān)基因的表達(dá)量變化情況如圖6所示,從圖6中可以看出,在原始培養(yǎng)基與檸檬酸培養(yǎng)基的紅曲菌菌絲體中,Monacolin K合成相關(guān)基因的表達(dá)量在2 d時無變化,后期呈現(xiàn)一定的上升趨勢,mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH、mokI和LaeA的表達(dá)水平與Monacolin K的合成趨勢呈正相關(guān)。因此檸檬酸可能對這些Monacolin K合成基因的表達(dá)量起到一定的促進(jìn)作用,也就是說,檸檬酸可能是通過上調(diào)這10段基因的表達(dá)量來刺激紅曲菌Monacolin K的合成。

圖6 發(fā)酵過程中Monacolin K生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量變化情況Fig.6 Expression of monacolin K biosynthesis-related genes during fermentation

3 結(jié)論

通過不同濃度檸檬酸的添加,與原始培養(yǎng)基中的M1菌株對比,分析檸檬酸對紅曲菌主要次級代謝產(chǎn)物Monacolin K產(chǎn)量的影響。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加檸檬酸的濃度在0.1%左右時,對Monacolin K產(chǎn)量的促進(jìn)效果最為明顯,即Monacolin K的產(chǎn)量提高了2.71倍。但加不同濃度檸檬酸后,均對紅曲紅色素、橙色素、黃色素色價有著一定程度的抑制作用。在生物量方面,并無顯著變化。后續(xù)通過掃描電鏡進(jìn)行菌絲體超微結(jié)構(gòu)觀察,發(fā)現(xiàn)檸檬酸可能提高了紅曲菌菌絲體通透性,加速了Monacolin K分泌到細(xì)胞外的過程,細(xì)胞質(zhì)中的Monacolin K濃度降低,進(jìn)而達(dá)到Monacolin K積累量增加的效果。最后通過RT-qPCR測定了紅曲菌Monacolin K合成相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),添加檸檬酸能夠促進(jìn)Monacolin K合成的關(guān)鍵基因mokA-mokI和LaeA的表達(dá)量,從而提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。