鹽酸戊乙奎醚對高氧所致幼鼠腦損傷時Shh/Gli1信號通路的影響

顏莉麗 陳 燕 程 閃 董鐵立 袁 峰

鄭州大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

盡管目前在產(chǎn)科和新生兒重癥監(jiān)護方面取得了重大進展，但早產(chǎn)兒仍易遭受中樞神經(jīng)功能障礙。由于內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的不成熟，早產(chǎn)兒和足月兒通常容易受到活性氧的傷害[1]。眾所周知，在新生兒生長和發(fā)育的關鍵階段接受高濃度氧會嚴重影響發(fā)育過程。近年來的研究表明，高氧還導致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡，導致腦損傷[2-3]。在大腦成熟的關鍵階段，高氧會改變發(fā)育過程，從而破壞神經(jīng)的可塑性和影響髓鞘的形成[4]。但是，在新生兒重癥監(jiān)護室中常常不可避免的進行氧氣治療。因此，在需要接受高氧治療的情況下，除了開發(fā)適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)外，還需要采取相關的保護策略。

研究表明，高氧所致腦損傷的誘導因素涉及氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡和神經(jīng)血管再生等[5-6]。Shh/Gli1信號通路參與多種組織損傷的修復過程，對多種組織細胞的凋亡具有重要的調(diào)控作用。近期的研究表明，Shh信號通路與腦損傷后神經(jīng)組織修復密切相關，可通過抗凋亡、抗氧化應激、保護血腦屏障以及促進神經(jīng)血管再生等多種機制保護腦組織[7-8]。鹽酸戊乙奎醚是一種新型的抗膽堿藥物，目前在臨床上已應用多年。近年來研究表明，鹽酸戊乙奎醚除了具有抗膽堿能受體的作用，還可調(diào)節(jié)善微循環(huán)，減輕氧化應激，抑制炎癥反應和抗細胞凋亡[9-10]。但鹽酸戊乙奎醚在高氧所致腦損傷中的作用及其機制研究鮮有報道。本研究擬建立幼鼠高氧所致腦損傷模型，以鹽酸戊乙奎醚進行預干預，闡述其對幼鼠高氧所致腦損傷時Shh/Gli1信號通路的影響。

1 材料與方法

1．1主要儀器及試劑有機玻璃氧箱(30 cm×20 cm×20 cm，自制)，F(xiàn)O-1型測氧儀(無錫法斯達醫(yī)學設備有限公司)，Elx-808酶標儀(BIO-TEK公司，美國)，Mini 垂直電轉儀和電泳儀(BIO-RAD公司，美國)，BA-200光學顯微鏡(Nicon公司，日本)，共聚焦激光掃描顯微鏡(Olympus公司，日本)，AL204電子稱(METTLER TOLEDO公司，美國)。氧氣(泉州市天星氣體有限公司)，鹽酸戊乙奎醚注射液(生產(chǎn)批號：170922，成都力思特制藥股份有限公司)，原位細胞凋亡檢測試劑盒(Promega公司，美國)，抗Shh抗體和抗-Gli1抗體(Santa Cruz 公司，美國)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)，Shh一抗、/Gli1一抗和GAPDH一抗(CST公司，美國)，二抗工作液(碧云天生物技術研究所)。

1．2實驗動物及分組清潔級14日齡Sprague-Dawley(SD)幼鼠共30只，均為雄性，體質(zhì)量40～50 g，購買于上海斯萊克實驗動物有限公司。所有幼鼠均飼養(yǎng)于清潔劑環(huán)境中，保持室溫22～25 ℃。實驗前幼鼠禁食6 h，不禁飲。按照隨機數(shù)字表法分為3組：對照組(C組)、高氧組(HO組)和高氧+鹽酸戊乙奎醚組(HP組)，每組10只。

1．3建立動物模型按照文獻報道的方法建立幼鼠高氧所致腦損傷模型[11]：幼鼠被置于有機玻璃氧箱，以2～3 L/min的流量持續(xù)輸注進入100%氧氣。內(nèi)置氧濃度儀持續(xù)監(jiān)測室內(nèi)氧濃度，保證氧濃度維持在(80.0±2.0)%，艙內(nèi)放置生石灰粉末作為干燥劑，吸收水蒸氣和多余的CO2。幼鼠自由進食及飲水。幼鼠共計吸氧7 d。HO組和HP組幼鼠均放置于有機玻璃氧箱中呼吸氧氣，C組幼鼠放置于有機玻璃氧箱之外呼吸正?？諝?。

1．4藥物干預從造模第一天起，HP組幼鼠均給予鹽酸戊乙奎醚劑量為0.3 mg/kg，于每日同一時間點給藥，共計7 d。C組和H組均于相同時間點給予等容量的生理鹽水。

1．5神經(jīng)功能缺損評分(NDS)實驗結束后進行NDS評定。評分內(nèi)容主要包括：意識狀態(tài)、呼吸頻率、顱腦神經(jīng)反射、運動感覺功能和協(xié)調(diào)功能等。分值0～100分，其中0分為正常，100分為腦死亡[12]。NDS完成后采用安樂死法處死幼鼠，留取海馬組織，做后續(xù)檢測。

1．6測定幼鼠海馬W/D比取海馬，充分漂洗，晾干后稱質(zhì)量，記為濕質(zhì)量(W)；70 ℃ 24 h烘干，稱質(zhì)量，記為干質(zhì)量(D)。W/D比=W÷D。

1．7光鏡下觀察幼鼠海馬組織形態(tài)學改變2%戊巴比妥50 mg/kg，腹腔注射。先將100 mL生理鹽水灌注入左心室-升主動脈，后以200 mL的4%多聚甲醛再次灌注，取出大腦，自視交叉后1 mm和4 mm處冠狀切面切開，立即投入4%多聚甲醛。制作石蠟切片。于海馬同一冠狀水平切片行脫蠟、蘇木精初染、伊紅復染、脫水、封片，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理學改變。每個標本隨機取3張切片，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)，每張切片觀隨機察3個不重疊的高倍視野(×400)，取平均值為正常錐體細胞計數(shù)。

1．8TUNEL法檢測幼鼠海馬組織細胞凋亡指數(shù)(AI)依據(jù)試劑盒說明書進行檢測。光鏡下，細胞核中有棕褐色或黃色顆粒者為陽性細胞，正常細胞細胞核為藍色。AI=凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%。

1．9免疫組化法觀察Shh和Gli1表達部位取石蠟切片，常規(guī)脫蠟、脫水，經(jīng)抗原修復、滅活酶后加入Shh和Gli1一抗并于濕盒中孵育2 h，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗進行孵育，30 min顯色，蘇木精復染，封固。每個標本隨機選取3張切片，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)，每張切片隨機取3個不重疊的高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細胞數(shù)，取3張切片的平均值以表示Shh和Gli1蛋白的活性。

1．10WesternBlot測定幼鼠海馬組織Shh和Gli1蛋白表達水平取海馬組織，按裂解液：蛋白組織：苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶10∶1比例加入，電動勻漿器至無組織殘渣，4 ℃下12000 rpm/min 離心20 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。煮沸至蛋白變性。取蛋白樣品，于12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，濕轉法轉移至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉在37 ℃水浴中封閉2 h，加入Shh一抗(1∶1 000)、Gli1一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，漂洗后加入二抗于37 ℃搖床孵育2 h。加入電化學發(fā)光(ECL)液，用顯影儀化學發(fā)光。采用Quantity One掃描分析系統(tǒng)軟件分析目的條帶灰度值。

2 結果

2．1各組幼鼠NDS、海馬W/D、AI和海馬CA1區(qū)正常錐體細胞計數(shù)的變化與C組比較HO組幼鼠NDS、海馬W/D、AI均升高(P<0.05)，海馬CA1區(qū)正常錐體細胞計數(shù)減少(P<0.05)。HP組幼鼠NDS、海馬W/D、AI均較HO組降低(P<0.05)，海馬CA1區(qū)正常錐體細胞計數(shù)較HO組增多(P<0.05)。見表1。

2．2各組幼鼠海馬組織病理學的變化C組海馬錐體細胞形態(tài)結構正常，排列整齊，基線清晰，細胞核形態(tài)正常，核仁明顯、深染。HO組海馬錐體細胞形態(tài)結構異常，排列紊亂，胞體縮小，胞核固縮，核碎裂甚至溶解。HP組海馬錐體細胞形態(tài)結構較完整，排列尚整齊，細胞基線較清晰，核固縮細胞減少，正常錐體細胞增多。見圖1。

表1 各組幼鼠NDS、海馬W/D、AI和海馬CA1區(qū)正常錐體細胞計數(shù)比較

注：與C組比較，aP<0.05；與HO組比較，bP<0.05

注：A：C組；B：HO組；C：HP組

圖1各組幼鼠海馬組織病理學的改變 (H&E，×400)Figure1Histopathological changes of the hippocampus of neonatal rats in each group (H&E，×400)

2．3各組幼鼠海馬組織細胞凋亡的變化TUNEL法顯示，C組幼鼠海馬組織中幾乎未見凋亡細胞。HO組幼鼠海馬細胞發(fā)生明顯凋亡，HP組幼鼠海馬組織中凋亡的細胞明顯減少。見圖2。

2．4各組幼鼠免疫組化法示海馬組織Shh和Gli1表達情況的比較免疫組化法顯示，Shh位于細胞膜和細胞質(zhì)中，Gli1表達于細胞質(zhì)和細胞核。見圖3、圖4。與C組比較，HO組海馬Shh和Gli1的表達水平顯著增加，Gli1部分轉移至細胞核；與HO組比較，HP組海馬Shh和Gli1的表達水平及Gli1的核移位進一步增加。見表2。

注：A：C組；B：HO組；C：HP組

圖2各組幼鼠海馬組織細胞凋亡的變化 (TUNEL，×200)

Figure2Changes of apoptosis of hippocampal tissues of neonatal rats in each group (TUNEL，×200)

注：A：C組；B：HO組；C：HP組

圖3各組幼鼠海馬CA1區(qū)Shh免疫組化染色(DAB，×400)

Figure3Immunohistochemical staining of Shh in hippocampal CA1area of neonatal rats in each group (DAB，×400)

注：A：C組；B：HO組；C：HP組

圖4各組幼鼠海馬CA1區(qū)Gli1免疫組化染色(DAB，×400)

Figure4Immunohistochemical staining of Gli1in hippocampal CA1area of neonatal rats in each group (DAB，×400)

2．5各組幼鼠海馬組織Shh和Gli1蛋白表達水平的變化與C組比較，HO組幼鼠海馬組織Shh和Gli1表達水平均升高(P<0.05)。HP組幼鼠海馬組織Shh和Gli1表達水平均較HO組均升高(P<0.05)。見表3、圖5。

表2 各組幼鼠海馬CA1區(qū)Shh和Gli1免疫組化陽性細胞計數(shù)比較

注：與C組比較，aP<0.05；與HO組比較，bP<0.05

組別Shh蛋白Gli1蛋白C組0.33±0.120.41±0.10HO組0.58±0.14a0.68±0.15aHP組0.78±0.21ab0.88±0.20ab

注：與C組比較，aP<0.05；與HO組比較，bP<0.05

圖5 各組幼鼠海馬組織Shh和Gli1蛋白表達量分析 (Western blot)Figure 5 The analysis of the expression of Shh and Gli1 protein in hippocampus tissues of neonatal rats in different groups (Western blot)

3 討論

研究證實，高氧在早產(chǎn)相關疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)和支氣管肺發(fā)育不良(BPD)等的發(fā)病機制中具有重要作用[13-14]。新生兒時期過早地接觸大量氧氣可能會破壞大腦的成熟。有證據(jù)表明，高氧對未成熟的大腦具有損害作用[15]。早產(chǎn)兒長期暴露于超生理水平的高氧條件下可能引起大腦早熟并伴有囊性或彌漫性腦白質(zhì)軟化的腦病[16]。而正常分娩的足月兒若發(fā)生窒息復蘇時接受高氧濃度的話則會顯著增加病死率和發(fā)病率[17]。在嚙齒動物中，高氧觸發(fā)的細微神經(jīng)變性與細胞凋亡、自噬、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和生長因子表達變化、氧化有關壓力、炎癥以及與突觸可塑性等有關[18-19]。因此，高氧所致腦損傷在新生兒或早產(chǎn)兒的防治中需要高度重視，對及發(fā)生機制也應積極去探索。

本實驗按照文獻報道的方法建立幼鼠高氧所致腦損傷模型[11]，即幼鼠被置于有機玻璃氧箱，保證氧濃度維持在(80.0±2.0)%，共計吸氧7 d。本實驗結果表明，長時間吸入高濃度氧后，幼鼠NDS、海馬W/D比和AI均明顯升高，海馬CA1區(qū)正常錐體細胞計數(shù)明顯減少。提示，長期暴露于高氧可促使幼鼠腦損傷的發(fā)生發(fā)展。同時，光鏡下可見，HO組幼鼠海馬錐體細胞形態(tài)結構異常，排列紊亂，胞體縮小，胞核固縮，核碎裂甚至溶解，TUNEL法顯示，HO組幼鼠海馬細胞發(fā)生明顯凋亡，提示長時間吸入高濃度的氧可損傷幼鼠海馬錐體細胞。因此，幼鼠高氧所致腦損傷模型復制成功。

本研究結合臨床實際并參照文獻報道[20]選取鹽酸戊乙奎醚的給藥劑量為0.3 mg/kg。結果顯示，給予鹽酸戊乙奎醚后，幼鼠NDS、海馬W/D和AI均降低，海馬CA1區(qū)正常錐體細胞計數(shù)增多，海馬錐體細胞形態(tài)結構較為完整，細胞基線較清晰，核固縮細胞減少，正常錐體細胞增多，海馬組織中凋亡細胞明顯減少。提示鹽酸戊乙奎醚可減輕高氧所致的腦損傷?；A研究表明，鹽酸戊乙奎可減輕小鼠腦缺血再灌注損傷[21]。因此，鹽酸戊乙奎醚的腦保護作用較為確切，而本研究結果再次印證了這一觀點。

Shh蛋白是Hh蛋白家族成員之一，Shh信號通路是生物進化中最為保守的信號通路之一，參與了脊椎動物和非脊椎動物胚胎發(fā)育的多個過程，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和器官的形成和構建至關重要。在經(jīng)典的Shh信號傳導中，Shh蛋白以自分泌或旁分泌方式與Patched受體結合，解除Patched對Smoothed受體的抑制作用，使Gli1、Gli2和Gli3進入細胞核并啟動控制細胞生長、存活和分化的一系列靶基因的表達，從而完成各種生物學作用[22]。既往研究認為，Shh信號通路僅在胚胎發(fā)育階段發(fā)揮作用，但近年來越來越多的研究表明，Shh信號通路還參與了出生后急性腦損傷、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、脫髓鞘、帕金森病、阿爾茨海默病等多種腦和脊髓疾病的發(fā)生發(fā)展[23，24]。給予外源性重組Shh蛋白可顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為學評分、減少腦梗死體積、促進缺血周圍組織的血管生成和神經(jīng)干細胞的定植[25]。另外，Gli1蛋白的高水平表達是Shh信號通路激活的明確標志[26]。本研究結果表明，長時間吸入高濃度氧后，Shh和Gli1表達上調(diào)，表明高氧激活了海馬組織中的Shh/Gli1信號通路；HP組Shh和Gli1的表達水平進一步上調(diào)，表明鹽酸戊乙奎醚促進了Shh/Gli1信號通路的進一步激活，因此，鹽酸戊乙奎醚的腦保護作用與Shh/Gli1信號通路的激活有關。但目前相關的研究較少，故需更深入的探究。

鹽酸戊乙奎醚對高氧所致腦損傷發(fā)生的幼鼠腦組織具有較好的保護作用，其機制可能與激活Shh/Gli1信號通路有關。