舒血寧注射液對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織的保護(hù)作用及其機(jī)制

焦光美，單海雷，張曉璇，趙 亮，竇志杰，康玲伶，馬 征，孫艷軍，楊 寧

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

急性腦梗死又稱為缺血性卒中，主要由于腦血管閉塞導(dǎo)致腦組織血液供應(yīng)不足引起缺氧，導(dǎo)致局限性腦組織缺血性損傷，具有極高的致殘率和致死率，臨床上常表現(xiàn)為腦功能減退，并且出現(xiàn)眩暈、頭痛、偏癱和意識(shí)障礙等癥狀[1-3]。急性腦梗死由瘀血阻塞經(jīng)絡(luò)引起，在中醫(yī)學(xué)上歸類于中風(fēng)，一般采用祛風(fēng)通絡(luò)法治療。舒血寧注射液為銀杏葉提取物，其有效成分主要為黃酮苷類、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯，具有擴(kuò)張血管及改善微循環(huán)的功效[4]。藥理學(xué)研究[5-6]表明：舒血寧注射液具有改善慢性腦供血不足、降低血液黏稠度、抑制血清炎癥因子表達(dá)和改善神經(jīng)功能的作用。生長分化因子 15(growth differentiation factor-15，GDF-15)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是心腦血管疾病重要的血清標(biāo)記物，能夠調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)心腦血管疾病的診斷有重要臨床意義[7]。GDF-15和CRP在機(jī)體內(nèi)有明顯的組織特異性，一般情況下在腦組織中只有微量表達(dá)[8]。心肌或腦等缺血損傷能夠誘導(dǎo)腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)[9]。目前國內(nèi)外有關(guān)舒血寧注射液對(duì)急性腦梗死的保護(hù)作用已有相關(guān)報(bào)道，但未見其對(duì)腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)水平影響的研究報(bào)道。本研究通過觀察舒血寧注射液對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)水平的影響，初步探討舒血寧注射液對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑50只健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，8周齡，由承德醫(yī)學(xué)院提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(冀)2017-001，自由攝食和飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。舒血寧注射液(規(guī)格：每支2 mL，河北神威藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z13020796)，尼莫地平(規(guī)格：每片20 mg，濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20000682)，GDF-15和CRP抗體(美國Santa Cruz公司)，二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)，2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)染液(南京建成生物工程研究所)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素1β(interleukin- 1β，IL-1β)(武漢博士德生物工程有限公司)。電子天平(YP600型，上海精密儀器儀表有限公司)，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(RM2235型，德國Leica公司)，超低溫冰箱(MDF-382E型，日本三洋公司)，光學(xué)顯微鏡和Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(日本尼康公司)，Motic B5顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組和大鼠腦梗死模型制備將50只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和舒血寧注射液組，每組10只。采用文獻(xiàn)[10]的方法建立大鼠急性腦梗死模型。大鼠術(shù)前禁食12 h，采用10%水合氯醛溶液(0.32 mL·kg-1)腹腔麻醉，于頸正中切口，鈍性分離大鼠皮下組織，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，分別采用線栓法結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈近心端。在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪1個(gè)小切口，將尼龍線從切口緩慢導(dǎo)入，松開頸內(nèi)動(dòng)脈夾，于頸內(nèi)動(dòng)脈16～17 mm處遇到阻力，長度約2 cm，用縫合線固定栓塞線，縫合皮膚，傷口外用青霉素軟膏。大鼠蘇醒后提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲、右眼Horner征、爬行時(shí)向左側(cè)劃圈、爬行時(shí)向左側(cè)傾倒為造模成功。假手術(shù)組大鼠分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈后，只結(jié)扎頸外動(dòng)脈；對(duì)照組大鼠不進(jìn)行手術(shù)處理；舒血寧注射液組大鼠造模成功后腹腔注射舒血寧注射液(劑量為0.4 mL·kg-1，按成人日用量4 mL并采用人與動(dòng)物體表面積法換算)[11],每日1次，連續(xù)給藥7 d；尼莫地平組大鼠造模后腹腔注射2.0 mg·kg-1尼莫地平。對(duì)照組、模型組和假手術(shù)組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分采用文獻(xiàn)[11]中的5分法對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。正常計(jì)0分，大鼠左側(cè)前肢無法伸展計(jì)1分，大鼠左側(cè)前肢屈曲計(jì)2分，大鼠稍有向左側(cè)繞圈者計(jì)3分，大鼠向左側(cè)繞圈嚴(yán)重者計(jì)4分，大鼠行走向左側(cè)傾倒者計(jì)5分，分?jǐn)?shù)越高表明大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4 各組大鼠腦組織含水量和相對(duì)腦梗死面積檢測采用文獻(xiàn)[12]的方法，各組大鼠10%水合氯醛麻醉后，迅速取腦組織，置于生理鹽水中清洗后，用濾紙吸干腦組織，立即分別稱質(zhì)量，該質(zhì)量為W1，然后將腦切片按組分別置于干燥的玻璃皿上，于100℃烘箱中烘干，室溫放涼后稱質(zhì)量，計(jì)為W2，根據(jù)2次稱質(zhì)量結(jié)果計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量=(W1-W2)/W1×100%。將腦組織切成2 mm厚冠狀切片，以2% TTC于37℃水浴中染色5～10 min后，采用4%多聚甲醛緩沖液固定，紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。采用顯微攝像系統(tǒng)檢測各組大鼠相對(duì)腦梗死面積。相對(duì)腦梗死面積=[對(duì)側(cè)腦半球面積-(缺血腦半球面積-梗死面積)/對(duì)側(cè)腦半球面積]×100%。

1.5 HE染色觀察各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)取每組大鼠腦皮層置于4℃生理鹽水沖洗，切成2 mm厚冠狀切片，以2% TTC于37℃水浴中染色5～10 min后，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚約4 μm，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)水平取各組大鼠腦組織切片，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，常規(guī)脫蠟脫水，3%H2O2孵育15 min，PBS溶液沖洗，置于枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)5 min，冷卻至室溫，加入一抗，4℃過夜，PBS沖洗，加入二抗，37℃下孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染1 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕褐色。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以數(shù)字圖像上計(jì)數(shù)單位細(xì)胞中GDF-15和CRP陽性細(xì)胞數(shù)表示GDF-15和CRP表達(dá)水平。

1.7 ELISA法檢測各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平將腦組織切片制成勻漿后，置于96孔板中，分別加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液和待測樣品，于37℃下放置60 min，洗滌，加入TNF-α、IL-6和IL-1β抗體100 μL，37℃ 放置60 min，洗滌，加入HRP標(biāo)記的親和素100 μL，于37℃放置30 min，洗滌，加入100 μL底物工作液(TMB)，37℃避光放置15 min，加入100 μL終止液。于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度(A)值，A值越高表明TNF-α、IL-6和IL-1β水平越高，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，單位為ng·L-1。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，計(jì)0分。與模型組比較，給藥第3和7天時(shí)尼莫地平組和舒血寧注射液組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

GroupScore of neurological impairment(t/d)137Control000Sham operation000Model4.6±0.34.3±0.13.1±0.2Nimodipine4.3±0.43.3±0.2*2.0±0.4*Shuxuening Injection4.3±0.33.5±0.1*2.3±0.4*

*P<0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠腦組織含水量和相對(duì)腦梗死面積與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平和舒血寧注射液組大鼠腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠無腦梗死，因此相對(duì)腦梗死面積計(jì)為0；與模型組比較，尼莫地平和舒血寧注射液組大鼠腦相對(duì)梗死面積明顯減小(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)完整，皮層神經(jīng)元排列整齊有序，層次清晰。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞胞漿和胞核皺縮，輕度腫脹，神經(jīng)細(xì)胞與毛細(xì)管周圍間隙較大，間質(zhì)疏松。與模型組比較，舒血寧注射液組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹程度及間質(zhì)疏松程度均減輕，病理形態(tài)表現(xiàn)與尼莫地平組相近。見圖1(插頁七)。

表2 各組大鼠腦組織含水量和相對(duì)腦梗死面積

GroupWater content in brain tissueRelative cerebral infarction area Control68.73±5.260Sham operation70.02±4.130Model83.64±6.37*△38.98±4.52 Nimodipine72.46±8.93#17.53±4.66#Shuxuening Injection75.25±4.18#20.13±3.04#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with model group.

2.4 各組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)水平對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織中有少量GDF-15和CRP陽性表達(dá)。與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，尼莫地平組和舒血寧注射液組大鼠腦組織中GDF-15表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，CRP表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表4、圖2(插頁七)和圖3(插頁七)。

表4 各組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達(dá)水平

GroupGDF-15CRPControl7.35±2.616.41±2.11Sham operation8.02±2.146.67±2.78Model24.65±2.04*△19.67±2.54*△Nimodipine28.41±3.59△#12.61±2.04#Shuxuening Injection33.45±4.99△#13.56±3.45#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with model group.

2.5 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組和舒血寧注射液組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見表5。

3 討 論

急性腦梗死是常見的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率等特點(diǎn)，給患者健康和生活質(zhì)量帶來了極大威脅，且增加了患者家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，該病近年來呈現(xiàn)年輕化趨勢。目前臨床上對(duì)急性腦梗死的治療主要采用抗凝、溶栓、降纖和抗血小板等方法，但目前尚無確切有效的治療方法[13-14]。舒血寧注射液中的銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯具有擴(kuò)張血管及改善微循環(huán)的功效，因而該藥具有通絡(luò)散瘀、擴(kuò)張血管及降低血黏度的功效，對(duì)急性腦梗死有顯著療效[15-17]。研究[6，18-19]表明：舒血寧注射液能改善患者腦部血供、降低血黏度和血漿纖維蛋白原水平、抗血小板聚集、抗炎癥損傷、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)腦血管血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)和神經(jīng)功能相關(guān)因子平衡。

表5 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平

GroupIL-6IL-1βTNF-αControl124.80±11.56108.84±9.5234.61±4.02Sham operation134.35±15.36112.46±10.4635.16±5.09Model223.85±22.52*△204.80±21.65*△62.31±5.47*△Nimodipine143.82±17.43#115.34±12.50#37.40±4.89#Shuxuening Injection167.47±20.62#121.46±13.75#38.21±3.32#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with model group.

GDF-15作為神經(jīng)元中的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其水平動(dòng)態(tài)變化可反映腦血管病的發(fā)生發(fā)展，反映腦損傷的嚴(yán)重程度，對(duì)腦血管疾病具有指導(dǎo)意義[20]。CRP參與腦組織炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在急性腦梗死發(fā)病過程中起重要作用[21]。IL-6和IL-1β在機(jī)體免疫應(yīng)答、骨髓造血和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，腦缺血后腦組織中IL-6 和IL-1β表達(dá)水平升高，且在缺血再灌注后期仍維持在較高水平[22-23]。TNF-α主要作用是提高機(jī)體免疫和促進(jìn)組織愈合，是具有多效性作用的促炎性細(xì)胞因子，可促進(jìn)腦缺血損傷區(qū)黏附分子的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤[24-25]。本研究結(jié)果顯示：大鼠造模后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，舒血寧注射液組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分較模型組明顯降低，腦組織含水量明顯降低，相對(duì)腦梗死面積明顯減小，說明舒血寧注射液能夠明顯改善神經(jīng)功能缺損，對(duì)腦梗死引起的神經(jīng)損傷有明顯的保護(hù)作用，與相關(guān)報(bào)道[12]一致。與模型組比較，舒血寧注射液組大鼠腦組織中CRP表達(dá)水平降低， TNF-α、IL-6 和IL-1β水平降低，GDF-15表達(dá)水平明顯升高，說明舒血寧注射液能夠通過上調(diào)GDF-15表達(dá)和抑制CRP表達(dá)從而減輕腦組織炎性反應(yīng)程度。

綜上所述，舒血寧注射液能通過上調(diào)腦組織中GDF-15表達(dá)、抑制CRP表達(dá)和降低細(xì)胞炎性因子水平改善急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能，減少腦梗死面積，對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能起保護(hù)作用。