美學(xué)區(qū)切牙拔牙創(chuàng)大鼠模型的建立和改良微創(chuàng)拔牙手術(shù)的效果評價

潘永生，鄺 融，孫 鐸，毛天嬌，姜可新，李 江

(1. 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130021；2. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長春130021)

在美學(xué)區(qū)，由于各種因素導(dǎo)致的拔牙手術(shù)常會引起拔牙部位牙槽骨持續(xù)吸收、降低和牙周軟組織塌陷，不利于后期美學(xué)修復(fù)治療[1]。因此建立美學(xué)區(qū)拔牙創(chuàng)模型并探討拔牙創(chuàng)在自然狀態(tài)下愈合或人為因素干預(yù)下牙槽骨和軟組織的修復(fù)及愈合機(jī)制有重大臨床意義[2]。嚙齒類動物發(fā)育迅速，因此常作為骨再生研究的實(shí)驗(yàn)對象，且其切牙區(qū)域的牙齦和牙槽骨結(jié)構(gòu)類似于人類美學(xué)區(qū)牙周組織結(jié)構(gòu)而受到廣泛關(guān)注[3-4]。

大鼠切牙拔牙創(chuàng)模型已廣泛應(yīng)用于大鼠牙囊干細(xì)胞提取和拔牙創(chuàng)植入材料促進(jìn)成骨等方面的研究[5-6]。然而由于大鼠切牙長而細(xì)，并且切牙組織在大鼠整個生命過程中持續(xù)不斷地生長，但未形成典型的根部，而是連接于牙槽窩內(nèi)的牙囊組織[7]，故在拔牙過程中容易出現(xiàn)牙冠碎裂、斷根或牙囊粘連牙根組織等情況而導(dǎo)致拔牙手術(shù)失敗。大鼠切牙近中的動脈血管位于齦緣下方，缺乏專業(yè)拔牙器械易導(dǎo)致術(shù)中大出血而引起大鼠窒息死亡[8]。常規(guī)的手術(shù)器械不僅會造成拔牙創(chuàng)大面積牙齦組織撕裂，還會導(dǎo)致牙槽骨骨折，從而影響大鼠前牙美學(xué)區(qū)的愈合程度[9]。因此采用合適的手術(shù)方式建立大鼠下頜切牙拔牙創(chuàng)模型對后期實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要[1]。但是國內(nèi)外有關(guān)在美學(xué)區(qū)域有效地建立大鼠拔牙創(chuàng)模型的相關(guān)報(bào)道較少，有關(guān)采用優(yōu)化微創(chuàng)手術(shù)進(jìn)行建模并維持拔牙窩軟、硬組織的研究少見報(bào)道，因而探討一種方便、實(shí)用且高效的微創(chuàng)手術(shù)建模方式具有重要研究意義[10]。

本文作者設(shè)計(jì)并完善了一種新型微創(chuàng)拔牙手術(shù)方式，通過改良既往拔牙實(shí)驗(yàn)技術(shù)和優(yōu)化臨床器械，不僅增加了大鼠切牙完整拔除的效果，降低了大鼠術(shù)中失血量，而且促進(jìn)了大鼠拔牙創(chuàng)周圍牙齦愈合及牙槽骨恢復(fù)程度。本研究為美學(xué)區(qū)拔牙創(chuàng)的建模提供了一種完整的微創(chuàng)手術(shù)方式，該技術(shù)為將臨床技巧與工具結(jié)合創(chuàng)新性地局部應(yīng)用于動物實(shí)驗(yàn)，不僅可以提高建模效果，還可以為研究美學(xué)區(qū)軟、硬組織愈合程度提供新方法。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

24只健康雄性SD大鼠，動物使用許可證號：SCXK(吉)2016-0011，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供，體質(zhì)量約為220 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組12只。水合氯醛(成都創(chuàng)龍化工有限公司)。阿替卡因腎上腺素注射液及專用注射器(法國必蘭公司)，光敏雕刻刀、牙齦分離器圖和止血鉗(彎鉗和直鉗)(西安英諾維機(jī)電科技有限公司)，可拆卸式直手機(jī)(成都創(chuàng)龍化工有限公司)一次性口腔器械盤等。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 對照組大鼠常規(guī)手術(shù)拔牙步驟 術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前第9、6和3天使用可拆卸式直手機(jī)沿大鼠切牙牙齦處切斷牙齒(圖1A，見插頁六)，為預(yù)防感染，常規(guī)用棉簽碘伏消毒。大鼠麻醉及牙齒拔除：在建模的第10天，采用10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)腹腔注射全身麻醉。碘伏棉簽消毒后，在拔除切牙的唇、舌側(cè)及近、遠(yuǎn)中使用口腔專用注射器行必蘭麻局部浸潤麻醉(圖1B,見插頁六)。使用探針在切牙的唇、舌側(cè)及近、遠(yuǎn)中分別分離牙齦組織(圖1C,見插頁六)，然后使用止血鉗沿著牙根生長方向拔除牙齒(圖1D，見插頁六)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)組大鼠微創(chuàng)手術(shù)拔牙步驟 術(shù)前準(zhǔn)備：在術(shù)前第9、6和3天，分別使用光敏雕刻刀及牙齦分離器將牙齦向牙根方向分離，并且分別在切牙的唇、舌側(cè)及近、遠(yuǎn)中部位利用杠桿原理對牙根施力，然后利用可拆卸式直手機(jī)沿著大鼠切牙的牙齦處切斷牙齒。大鼠麻醉：在建模的第10天，局部麻醉和全身麻醉方法同上，在局部注射麻醉過程中，注意在切牙近中勿將注射器針頭探入過深以防刺破血管引發(fā)全身反應(yīng)。牙齒拔除：將適量棉花塞入大鼠口腔，以防止血液和唾液誤吸。該手術(shù)采用的手術(shù)器械均通過高溫高壓滅菌。使用光敏雕刻刀(圖2A，見插頁六)和牙齦分離器(圖2B，見插頁六)沿著牙根方向分離牙齦,并在近、遠(yuǎn)中部位使用杠桿力撬動牙根。然后在止血鉗(圖2C，見插頁六，綠色箭頭指示施力方向)上纏上棉花，以防止牙齒的牙冠部分被夾碎，并使用相對恒定的力量沿著牙根生長方向拔除牙齒。牙齒拔除過程中不能使用任何旋轉(zhuǎn)和搖晃力量，術(shù)中及時止血。 牙齒拔出后，及時利用纏有棉花的探針注入拔牙窩中止血，5～10 min后取出，然后使用5-0縫線縫合傷口(圖2D，見插頁六)。術(shù)中采用四手操作：術(shù)者在操作時由助手配合保持大鼠的開口度并保證大鼠呼吸順暢,及時清除手術(shù)區(qū)域的唾液與血液,密切觀察大鼠生命體征。

1.3 大鼠術(shù)后護(hù)理和處置

手術(shù)后將2組大鼠放置于干凈衛(wèi)生和通風(fēng)良好的鼠籠中飼養(yǎng),并維持籠內(nèi)溫度約為25℃。大鼠蘇醒后采用軟食飼養(yǎng)24 h，于術(shù)后第1周和第4周觀察2組大鼠拔牙傷口的愈合情況。

1.4 2組大鼠存活率

記錄術(shù)中和術(shù)后存活大鼠數(shù)，計(jì)算大鼠存活率,同時記錄2組大鼠死亡數(shù)。大鼠存活率=存活大鼠數(shù)/大鼠總數(shù)×100%。

1.5 2組大鼠體質(zhì)量檢測

分別記錄2組大鼠在圍手術(shù)期(包括術(shù)前第9、6和3天)和手術(shù)時體質(zhì)量及術(shù)后第7和14天體質(zhì)量。

1.6 2組大鼠切牙完整拔除率

切牙完整拔除定義為牙冠和牙根完全拔除，并伴有或未伴有牙囊組織。記錄每組大鼠完整拔除切牙數(shù)，計(jì)算切牙完整拔除率。切牙完整拔除率=完整拔除切牙數(shù)/大鼠牙齒總數(shù)×100%。

1.7 2組大鼠拔牙創(chuàng)周圍軟組織和牙槽骨愈合情況

術(shù)后1周觀察對照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠拔牙創(chuàng)周圍軟組織愈合情況；術(shù)后4周觀察對照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨愈合情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠存活率

對照組：術(shù)中大鼠死亡2只(麻醉過量死亡1只，血液誤吸死亡1只);術(shù)后第14天，大鼠死亡1只(漲氣死亡),存活率為75%。實(shí)驗(yàn)組：術(shù)后大鼠死亡1只(漲氣死亡)，存活率為92%。實(shí)驗(yàn)組大鼠存活率高于對照組(P<0.05)。

2.2 2組大鼠體質(zhì)量

術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量高于對照組(P<0.05)，微創(chuàng)手術(shù)對大鼠刺激較小，實(shí)驗(yàn)組大鼠在術(shù)后可以較快生長，見圖3。

1:9 d before surgery;2:6 d before surgery;3:3 d before surgery;4:During surgery;5:7 d after surgery;6:14 d after surgery.

圖3 不同時間2組大鼠體質(zhì)量

Fig.3 Body weights of rats in two groups at different time points

2.3 2組大鼠切牙完整拔除率

實(shí)驗(yàn)組大鼠可見拔除的切牙完整連續(xù)(圖4A，見插頁六)，牙根底部伴有牙囊組織，切牙拔牙創(chuàng)未見明顯的牙齦和牙槽骨損傷(圖4B，見插頁六)。實(shí)驗(yàn)組大鼠完整拔除11顆切牙,切牙完整拔除率為92% (圖4C，見插頁六)；對照組完整拔除5顆,切牙完整拔除率僅為42% (圖4D，見插頁六)；實(shí)驗(yàn)組大鼠切牙完整拔除率高于對照組(χ2=6.75，P<0.05)。

2.4 2組大鼠拔牙創(chuàng)軟組織和牙槽骨愈合情況

軟組織愈合：對照組大鼠在術(shù)后第1天可見牙齦撕裂傷，術(shù)后第7天后可見拔牙創(chuàng)周圍軟組織紅腫(圖5A,見插頁六)。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后第1天均見拔牙創(chuàng)周圍軟組織輕微紅腫,未見明顯損傷;術(shù)后第7天拔牙創(chuàng)愈合均良好(圖5B，見插頁六)。

牙槽骨愈合：術(shù)后1個月通過Micro-CT分析大鼠拔牙創(chuàng)牙槽骨愈合情況。對照組大鼠拔牙窩(圖5C，見插頁六)愈合不佳，再生的骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，牙槽骨的牙槽脊頂處未形成良好的骨閉合；實(shí)驗(yàn)組大鼠拔牙窩(圖5D，見插頁六)愈合良好，新生骨組織位于拔牙窩內(nèi)，新生骨與宿主骨之間過度自然，且牙槽脊頂處形成良好的骨閉合作用。

3 討 論

大鼠切牙的拔牙創(chuàng)模型是研究美學(xué)區(qū)拔牙窩骨愈合的一個經(jīng)典模型，并且其愈合過程可以分為3個不同階段：①凝結(jié)物的形成和細(xì)胞增殖; ②結(jié)締組織的形成和愈合；③在術(shù)后第28天時完成了骨改建和骨再生過程，相當(dāng)于人類術(shù)后第64天的愈合結(jié)果[8]。因此，成功建立大鼠美學(xué)區(qū)切牙拔牙創(chuàng)模型對于探討拔牙創(chuàng)軟、硬組織的修復(fù)過程具有重要臨床意義。但是大鼠切牙牙齒細(xì)長而脆，牙根位于磨牙下方并連接牙囊組織，更重要的是切牙組織伴有一定弧度[11-12]，故常規(guī)手術(shù)方式很難完整拔除切牙并保留牙周組織，一旦牙根在體內(nèi)折斷，缺乏專業(yè)器械進(jìn)行處理，不僅影響大鼠拔牙創(chuàng)模型制作，還會進(jìn)一步影響美學(xué)區(qū)軟、硬組織的恢復(fù)[13]，因此有必要研究一種適用于美學(xué)區(qū)的微創(chuàng)拔牙方式，以提高大鼠切牙完整拔除率。

改良微創(chuàng)拔牙手術(shù)是通過對既往實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)的改良和常規(guī)臨床器械的優(yōu)化應(yīng)用，在不添加復(fù)雜手術(shù)器械的條件下完成整個手術(shù)，該微創(chuàng)手術(shù)方法適于臨床推廣應(yīng)用。在拔牙手術(shù)前，在對應(yīng)的時間點(diǎn)分別采用分離器分離牙齦并沿著平齦緣方向磨除大鼠的切牙牙冠，大鼠的切牙在3 d后可以恢復(fù)到原有牙齒長度的2/3。這是由于大鼠切牙具有獨(dú)特的牙囊組織，其可以促進(jìn)牙齒在切牙水平上不斷生長[14]。牙囊組織受到局部刺激可以促進(jìn)牙冠爆發(fā)性生長，切牙周圍的牙齦組織受到外界分離器械的影響,進(jìn)一步促進(jìn)牙周組織水腫[5]。使用牙齦分離器械和光敏雕刻刀切除牙冠附著的牙周韌帶，不僅進(jìn)一步減少切牙冠方的阻力，而且保留了美學(xué)區(qū)牙齦組織，為后期軟組織修復(fù)提供了基礎(chǔ)。術(shù)后適當(dāng)?shù)闹寡胧┻M(jìn)一步降低了大鼠牙齦組織的損傷[15]。本研究結(jié)果顯示：采用改良方式操作的大鼠存活率提高、拔除牙齒完整數(shù)增加、拔牙創(chuàng)軟組織損傷減少并且愈合快且好。

傳統(tǒng)手術(shù)方式采用探針分離牙齦、挺松牙齒，改良微創(chuàng)手術(shù)則是利用臨床上常規(guī)的牙齦分離器及光敏雕刻刀作為牙齦分離器和牙挺。牙齦分離器和光敏雕刻刀具有更為細(xì)小的組織分離功能和強(qiáng)大的支撐作用,在分離牙齦及挺松牙齒過程中操作更加便利[16]。雖探針可應(yīng)用于大鼠的拔牙過程，但探針具有較小的尖端，很大程度上會造成牙周組織的損傷，并且由于探針頸部較粗，分離和挺松大鼠的磨牙相對容易，但由于切牙的牙齦組織更為密合且堅(jiān)韌，使用探針分離容易造成牙齦組織分離不徹底且伴有較大的損傷[12,17]。光敏雕刻刀有薄且鋒利的刀刃，更容易插入牙周間隙切斷附著的膠原纖維，伴有一定的弧度可以形成良好的杠桿作用[18]。止血鉗上纏繞棉卷不僅降低切牙牙冠碎裂的風(fēng)險，而且增強(qiáng)了對切牙牙冠的摩擦力,避免了因支點(diǎn)受力不均勻而導(dǎo)致的牙根折斷，同時也避免了止血鉗誤將牙齦組織卷入而造成牙齦撕脫。本文作者嚴(yán)格遵守牙挺和牙鉗的使用原理和操作步驟，提高了切牙完整拔除率[19]。

前牙美學(xué)區(qū)拔牙創(chuàng)的恢復(fù)不僅需要良好的骨組織支撐，還應(yīng)具有良好的形態(tài)和外觀[20]。拔牙窩的及時止血對術(shù)后的拔牙創(chuàng)愈合及抑制牙槽骨吸收具有極大影響[21]。拔牙手術(shù)不可避免地會造成軟組織和牙槽骨的損傷并進(jìn)一步誘導(dǎo)牙槽脊吸收，不利于后期牙槽脊軟、硬組織的恢復(fù)和治療[22]。在本文作者設(shè)計(jì)的微創(chuàng)拔牙手術(shù)方案中，利用四手操作在牙齒拔除后迅速采用纏繞棉卷的探針插入拔牙窩中，從而有效地抑制了大鼠拔牙窩出血。在牙齒拔除后將牙齦組織恢復(fù)至原有形狀和位置，從而在術(shù)后維持了原有軟組織的尺寸及豐滿度，滿足美學(xué)區(qū)對牙齒拔牙手術(shù)的要求[23]。微創(chuàng)手術(shù)更加符合動物福利及3R原則：reduction(減少)、replacement(替代)和refinement(優(yōu)化)[24]，減少實(shí)驗(yàn)操作對動物造成的刺激、痛苦及恐懼，降低手術(shù)失敗率，并節(jié)省了該環(huán)節(jié)中造成的人力和物力浪費(fèi)。

本研究結(jié)果表明：改良的微創(chuàng)拔牙方法可以明顯提升美學(xué)區(qū)牙齒的拔除效果，并且最大程度地保留了原有牙槽骨軟、硬組織尺寸，從而為后期軟、硬組織修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在美學(xué)區(qū)建立拔牙創(chuàng)模型提供了思路和方法，同時微創(chuàng)拔牙方式也可為構(gòu)建美學(xué)區(qū)牙槽脊保存實(shí)驗(yàn)動物模型提供了新策略。