線粒體動(dòng)力學(xué)改變對APP/PS1小鼠移植黑色素瘤生長的抑制作用

林久涵，田 琳，張娜娜，董 營，呂 航，王 丹，曲 萌，張 勇，孫連坤，于春艷，劉 希

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132013；2. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系， 吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；4. 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長春 130021；5. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室，吉林 吉林 132013)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)和惡性腫瘤是威脅人類健康的兩大疾病。線粒體功能障礙是神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤病理生理過程的關(guān)鍵因素[1-2]。線粒體功能與線粒體動(dòng)力學(xué)相協(xié)調(diào)，線粒體動(dòng)力學(xué)包括線粒體融合和分裂及線粒體自噬等[3-4]。線粒體本身處于一種動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)，在融合和分裂之間變化；線粒體自噬與線粒體分裂融合過程關(guān)系密切，當(dāng)線粒體分裂融合失衡時(shí)，線粒體自噬便被啟動(dòng)，清除受損的線粒體[5-8]。線粒體動(dòng)力學(xué)在細(xì)胞器水平上監(jiān)測著線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。在同一例老年患者中鮮有同時(shí)發(fā)生AD和惡性腫瘤的情況[9-10]，但其機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，移植黑色素瘤B16細(xì)胞，復(fù)制同時(shí)患AD和惡性腫瘤的動(dòng)物模型，探討線粒體分裂和融合及線粒體自噬的變化對移植瘤生長的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器7只健康C57BL/6J小鼠和7只APP/PS1小鼠，體質(zhì)量16～20 g，雄性，購自北京華阜康股份有限公司，SPF級，動(dòng)物使用許可證號：SCXK(京)2014-0004。所有小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)和安靜環(huán)境中，定時(shí)喂食，飲水不限。黑色素瘤B16細(xì)胞為吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系提供。線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)、動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin related protein， Drp1)、線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission 1， Fis1)、泛素化及多泛素化蛋白(ubiquitin and polyubiquitin)、PTEN誘導(dǎo)假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1， PINK1)、Parkin和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，LC3抗體購自美國Abcam公司。蛋白濃度分析儀、蛋白質(zhì)電泳裝置、轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 C57BL/6J 和APP/PS1小鼠黑色素瘤模型的建立取7只C57BL/6J小鼠(C57移植瘤組)和7只APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PS1移植瘤組)建立移植瘤模型。培養(yǎng)B16細(xì)胞，取處于對數(shù)生長期B16細(xì)胞，采用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細(xì)胞。采用無菌PBS洗滌2次，再采用PBS重懸，細(xì)胞濃度為1×107mL-1，采用無菌注射器將100 μL細(xì)胞懸液接種到小鼠背部右側(cè)皮下[11]。小鼠飼養(yǎng)在22 ℃～24 ℃、濕度為40%～60%動(dòng)物房中，每天觀察小鼠狀態(tài)和腫瘤生長狀況，并每2 d用游標(biāo)卡尺測量和記錄腫瘤直徑和體積，觀察腫瘤成瘤時(shí)間、成瘤率和生長時(shí)間，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=長×寬×高×π/6。

1.3 光學(xué)顯微鏡下觀察2組小鼠移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)采用10%水合氯醛麻醉小鼠，將胸廓剪開，暴露心臟，把灌注針頭經(jīng)左心室刺入至主動(dòng)脈，用止血鉗加以固定，然后剪開右心房，先用生理鹽水對其進(jìn)行快速灌注沖洗直至臟器變白，然后以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)對其進(jìn)行灌注固定，最后將小鼠處死，取出完整皮下移植瘤組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h。采用常規(guī)方法經(jīng)過脫水、透明、包埋和切片制作石蠟切片，HE染色，封片，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.4 Western blotting法檢測2組小鼠腫瘤組織中Mfn2、Drp1、Fis1、泛素化及多泛素化蛋白、LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平按1 mL·100 mg-1的量加入RIPA組織裂解液，提取總蛋白。采用Bio-Rad法測定蛋白濃度，配制12%聚丙烯酰胺凝膠，以β-actin作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，取30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并采用恒壓(100 V)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，之后用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，采用含0.01% Tween20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的抗體Mfn2(1∶200)、Fis1(1∶200)、Drp1(1∶200)、泛素化及多聚泛素化蛋白(1∶200)、LC3-Ⅱ(1∶1 000)、PINK1(1∶200)、Parkin (1∶200)和β-actin (1∶200)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，37℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參照，進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，各個(gè)條帶蛋白表達(dá)水平采用吸光度(A)值表示，計(jì)算2組小鼠移植瘤組織中Mfn2、Fis1、Drp1、泛素化和多聚泛素化蛋白、LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶A值/β-actin條帶A值。

2 結(jié) 果

2.1 移植黑色素瘤后2組小鼠腫瘤體積C57移植瘤組小鼠接種黑素瘤B16 細(xì)胞第4天開始出現(xiàn)腫瘤，第5天全部出現(xiàn)腫瘤，第11天腫瘤體積為(94.5±12.1)mm3。APP/PS1移植瘤組小鼠第7天開始出現(xiàn)腫瘤，第9天全部出現(xiàn)腫瘤，第11天腫瘤體積為(19.1±8.9)mm3，2組小鼠腫瘤生成曲線見圖1。與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組出現(xiàn)腫瘤時(shí)間晚，腫瘤體積小(P<0.05)。

*P<0.05 compared with C57 transplantation tumor group.

2.2 光學(xué)顯微鏡下2組小鼠腫瘤組織形態(tài)表現(xiàn)C57移植瘤組和APP/PS1移植瘤組小鼠皮下可見黑色素瘤組織，呈現(xiàn)實(shí)體瘤形態(tài)，腫瘤組織中含有黑色素顆粒，與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腫瘤組織黑色素顆粒數(shù)量減少，顏色淡染。見圖2(插頁四)。

2.3 2組小鼠腫瘤組織中Mfn2、Drp1和Fis1蛋白表達(dá)水平與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腫瘤組織中表達(dá)水平降低(P<0.05)，Drp1及Fis1表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖3。

2.4 2組小鼠腫瘤組織中泛素化及多泛素化蛋白表達(dá)水平泛素化及多泛素化蛋白表達(dá)檢測結(jié)果顯示：與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腫瘤組織中泛素化及多泛素化蛋白表達(dá)水平升高。見圖4。

2.5 2組小鼠腫瘤組織中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腫瘤組織中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖5。

2.6 2組小鼠腫瘤組織中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腫瘤組織中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。見圖6。

Lane 1: C57 transplantation tumor group; Lane 2: APP/PS1 transplantation tumor group.n=3,*P<0.05 compared with C57 transplantation tumor group.

圖3 2組小鼠腫瘤組織中Mfn2、Drp1和Fis1蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.3 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of Mfn2, Drp1 and Fis1 proteins in tumor tissue of mice in two groups

Lane 1: C57 transplantation tumor group; Lane 2: APP/PS1 transplantation tumor group.n=3,*P<0.05 compared with C57 transplantation tumor group.

圖4 2組小鼠腫瘤腫瘤組織中泛素化及多泛素化蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of ubiquitin and polyubiquitin protein in tumor tissue of mice in two groups

Lane 1: C57 transplantation tumor group; Lane 2: APP/PS1 transplantation tumor group. 1:C57 transplantation tumor group;2:APP/PS1 transplantation tumor group.n=3,*P<0.05 compared with C57 transplantation tumor group.

圖5 2組小鼠腫瘤組織中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.5 Electrophoregram (A) and histogram (B) of LC3-Ⅱ protein in tumor tissue of mice in two groups

Lane 1: C57 transplantation tumor group; Lane 2: APP/PS1 transplantation tumor group.n=3,*P<0.05 compared with C57 transplantation tumor group.

圖6 2組小鼠腫瘤腫瘤組織中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of PINK1 and Parkin proteins in tumor tissue of mice in two groups

3 討 論

本研究基于同時(shí)患有AD和惡性腫瘤的動(dòng)物模型，從線粒體動(dòng)力學(xué)平衡角度，探討移植瘤小鼠腫瘤生長情況的差異及可能的作用。有研究[12]顯示：在APP 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的腦皮質(zhì)中，免疫沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：β-淀粉樣蛋白(Aβ)與Drp1 相互作用，誘導(dǎo)線粒體分裂，抑制線粒體融合。Mfn2功能失調(diào)與AD之間有關(guān)聯(lián)。AD患者額葉皮質(zhì)中Mfn2水平降低，患者尸檢結(jié)果[13]顯示：海馬神經(jīng)元中Mfn2水平也降低。Mfn2 mRNA和蛋白表達(dá)水平在不同類型的惡性腫瘤中均降低，使腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14]，提示線粒體融合/分裂平衡的變化不僅與AD病變的線粒體功能障礙有關(guān)，而且還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：APP/PS1移植瘤組小鼠腫瘤組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平降低，Drp1及 Fis1蛋白表達(dá)水平均升高，提示APP/PS1小鼠移植瘤組織中線粒體融合和分裂發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為線粒體融合不足及過度線粒體分裂，致使線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，可能累及腫瘤組織細(xì)胞的增殖，這可能是 APP/PS1移植瘤組織生長緩慢的原因。

有研究[15]顯示：在饑餓時(shí)線粒體缺乏Mfn2，線粒體融合減少，發(fā)生自噬降解。沉默Drp1后可以降低魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的線粒體自噬以及細(xì)胞凋亡，Drp1參與魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型發(fā)生線粒體自噬[16]?？梢姰?dāng)線粒體融合和分裂發(fā)生變化時(shí)，線粒體自噬便被啟動(dòng)[17]。線粒體自噬紊亂在AD和腫瘤中已有許多報(bào)道[8,14]。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中可見線粒體嵴受損傷以及線粒體碎片，還可見自噬蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高。盡管有研究[18]顯示：AD患者大腦中存在大量未降解的線粒體自噬體，但Aβ注入小鼠海馬CA區(qū)誘導(dǎo)AD模型可見線粒體自噬標(biāo)志物水平顯著升高，同時(shí)檢測到PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平均升高[19]，提示線粒體自噬在AD發(fā)病時(shí)期增強(qiáng)。線粒體自噬能很好地起到控制腫瘤細(xì)胞質(zhì)量的作用。在肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和結(jié)腸癌等各種腫瘤組織中常檢測到Parkin突變[20]。在腫瘤生長初期，線粒體自噬可通過減少細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和基因組損傷，以保證細(xì)胞代謝的正常，防止腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展；在腫瘤生長的后期，線粒體自噬會在腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞增殖會隨著線粒體自噬水平的升高受到限制。本研究結(jié)果顯示：APP/PS1移植瘤組織中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平均升高。已經(jīng)有研究[21]顯示：Parkin基因與人類結(jié)直腸癌的腺瘤性息肉病呈顯著相關(guān)性，Parkin過度表達(dá)抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，提示PINK1/Parkin信號途徑作為自噬和線粒體異常消除的關(guān)鍵因素之一，參與APP/PS1移植瘤組織的線粒體自噬調(diào)節(jié)，并影響腫瘤細(xì)胞增殖，這可能與 APP/PS1荷瘤組腫瘤組織生長緩慢有關(guān)。

線粒體功能與線粒體動(dòng)力學(xué)活動(dòng)相協(xié)調(diào)。線粒體動(dòng)力學(xué)由其融合與裂變的平衡以及線粒體自噬等嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)APP進(jìn)入線粒體后可以與線粒體內(nèi)膜上的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ結(jié)合影響線粒體ATP活性[22]。3月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠的線粒體膜電位和ATP水平降低。能量代謝障礙被認(rèn)為是AD早期發(fā)病和疾病進(jìn)展的共性環(huán)節(jié)，研究[23]表明：能量代謝障礙會促進(jìn)氧化應(yīng)激和AD病理產(chǎn)物累積。人肝癌組織中Drp1與Mfn2比值明顯升高，比值越大預(yù)后越不佳[24]，線粒體的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)變化也影響細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)[25-26]。Mfn2缺失抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ等某些亞基表達(dá)，從而導(dǎo)致其酶活性降低。在能量供應(yīng)不足的情況下，自噬清除受損傷線粒體又增加了機(jī)體對能量的需求，致使能量供應(yīng)與需求的極度不平衡，說明細(xì)胞命運(yùn)與細(xì)胞的代謝狀態(tài)存在內(nèi)在聯(lián)系。本研究從細(xì)胞器水平將線粒體質(zhì)量控制與生物能量聯(lián)系起來，突出了線粒體分裂和融合的平衡及線粒體自噬在同時(shí)患有AD和腫瘤的動(dòng)物模型體內(nèi)的關(guān)鍵作用，使得線粒體動(dòng)力學(xué)成為評價(jià)腫瘤和AD內(nèi)在聯(lián)系的分子標(biāo)志。本研究結(jié)果為臨床治療AD提供理論依據(jù)。