乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a基因的網(wǎng)絡(luò)分析

徐鳳英， 劉 儒， 馬 麗， 曲一帆， 肖偉利， 王玉珍，謝基明

( 1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

Rab7a基因和Rab7b基因是Rab7基因家族的2個同源亞型，具有較高的序列相似性[1]。與負(fù)責(zé)從核內(nèi)體向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的Rab7b不同[2]，Rab7a位于晚期核內(nèi)體，控制向內(nèi)吞降解室的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。Rab7a是溶酶體、吞噬體和自噬體成熟所必需的，并已被證明可調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和凋亡。最近報(bào)道[4]表明：Rab7a在癌癥中也發(fā)揮了重要作用。波形絲蛋白是反映上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個指標(biāo)[5]，在癌細(xì)胞中由Rab7a調(diào)控[6]。伏立諾和辛伐他汀可通過抑制Rab7協(xié)同抑制三陰性乳腺癌(tripe-negative breast cancer,TNBC)的發(fā)展[7]。然而目前尚未見關(guān)于Rab7a相關(guān)聯(lián)基因如何參與TNBC發(fā)生發(fā)展的報(bào)道。本研究利用慢病毒載體敲除TNBC MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a基因，通過與陰性對照組比較，對差異基因進(jìn)行分析，推斷Rab7a及其關(guān)聯(lián)基因的相互作用以及其可能參與的重要病理過程。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒、主要試劑和儀器人乳腺癌ZR-75-30、T-47D、HCC-1937、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。慢病毒lv-Rab7a-sgRNA和陰性對照CON251購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，Ausbian胎牛血清(FBS)購自上海威正翔禹生物科技有限公司，BCA試劑盒和RIPA裂解液均購自上海碧云天生物有限公司。 anti-Rab7a和anti-GAPDH均購自美國Santa Cruz公司，TRIzol試劑盒購自上海普飛公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP和Rnase Inhibitor均購自北京Promega公司，SYBR Master Mixture購自日本TaKaRa公司，人基因表達(dá)譜芯片(貨號:901838)、安捷倫RNA 6000 Nano 試劑盒、3′IVT PLUS基因芯片和基因芯片雜交洗滌染色試劑盒均購自美國Affymetrix公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌ZR-75-30、T-47D和HCC-1937 細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，乳腺癌MCF-7細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，MDA-MB-231細(xì)胞采用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基中血清含量均為10%。MDA-MB-231 細(xì)胞隔天換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90% 融合時(shí)，采用含 EDTA 的 PBS 平衡鹽溶液漂洗，再采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blotting法檢測乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937細(xì)胞中Rab7a蛋白表達(dá)水平收集對數(shù)生長期目的細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白水平。取50 μg蛋白樣品按比例加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻離心后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，采用濕轉(zhuǎn)法120 V、90 min將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后采用磷酸鹽緩沖液和吐溫20 (TBST)溶解的5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，阻斷與抗體的非特異性結(jié)合。膜與一抗(1∶1 000) 4℃孵育過夜，次日采用TBST洗滌3次(每次10 min)，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000) 2 h，TBST洗滌3次(每次10 min)后檢測PVDF膜上Rab7a蛋白表達(dá)水平。

1.4 慢病毒載體介導(dǎo)的Rab7a基因敲除將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為(3～5)×104mL-1的細(xì)胞懸液，取2 mL接種于 6孔板 ，培養(yǎng)24 h后，采用感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞以敲除Rab7a基因，培養(yǎng)12 h后采用完全培養(yǎng)液代替病毒感染液繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒載體上的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)率為90%時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)Rab7a基因敲除效率的驗(yàn)證。Rab7a基因敲除組根據(jù)敲除的4種不同Rab7a基因序列分為KD1組、KD2組、KD3組和KD4組，并設(shè)置陰性對照組。各組Rab7a基因敲除序列見表1。

表1 各組Rab7a基因敲除序列

1.5 qPCR法檢測各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a基因敲除效率采用TRIzol試劑盒對病毒感染的各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行裂解和總RNA提取。取2 μg總RNA和2 μL反轉(zhuǎn)錄引物，根據(jù) M-MLV試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qPCR法擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。Rab7a基因敲除效率為Rab7a mRNA表達(dá)水平降低百分比，Rab7a mRNA表達(dá)水平以每組測得的目的基因Rab7a和內(nèi)參基因GAPDH的CT值并采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=陰性對照組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值。Rab7a基因引物序列見表2。

表2 Rab7a基因和內(nèi)參基因引物序列

Tab.2 Primer sequences of Rab7a gene and internal reference gene

GeneSequence (5'-3')Rab7a senceGTCGGGAAGACATCACTCARab7a antisenceCTAGCCTGTCATCCACCATGAPDH senceTGACTTCAACAGCGACACCCAGAPDH antisenceCACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

1.6 芯片實(shí)驗(yàn)采用TRIzol法抽提陰性對照組和KD2組樣品總RNA，抽提所得總RNA經(jīng)NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100質(zhì)檢，合格樣本進(jìn)入芯片實(shí)驗(yàn)。芯片實(shí)驗(yàn)的步驟主要包括樣品的制備、芯片雜交、芯片洗染、芯片掃描和結(jié)果分析。

1.7 Rab7a基因敲除后一體化通路分析(IPA)IPA是一個一體化在線整合分析軟件(www.ingenuity.com)[8]，用于基因、microRNA數(shù)據(jù)和小規(guī)模實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。IPA建立了可視化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，用于理解基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)和藥物等屬性，同時(shí)可呈現(xiàn)分子之間相互作用的關(guān)系網(wǎng)。IPA使用網(wǎng)絡(luò)生成算法，按照本課題組預(yù)設(shè)的網(wǎng)絡(luò)大小將分子之間的網(wǎng)絡(luò)圖分割成多個網(wǎng)絡(luò)，并給每一個網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行打分。Score基于P值計(jì)算，反映了網(wǎng)絡(luò)中的數(shù)據(jù)集分子出現(xiàn)在該網(wǎng)絡(luò)中為隨機(jī)過程的概率。Score打分是基于超幾何分布，通過右尾的Fisher精確檢驗(yàn)獲得顯著性水平的負(fù)對數(shù)值。所有的網(wǎng)絡(luò)使用Score值進(jìn)行排序。Score值大于2代表該功能被顯著激活，Score值小于-2代表該功能被顯著抑制。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺癌細(xì)胞中Rab7a蛋白表達(dá)以表達(dá)Rab7a的293T細(xì)胞作為陽性對照，收集對數(shù)生長期乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937細(xì)胞總蛋白，Western blotting法分析結(jié)果顯示：與陽性對照組比較，乳腺癌ZR-75-30、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937細(xì)胞中均可見Rab7a蛋白表達(dá)。見圖1。

Lane 1： Positive control group(293T cells);Lane 2：ZR-75-30 cells；Lane 3：MCF-7 cells；Lane 4：T-47D cells；Lane 5：MDA-MB-231 cells；Lane 6：HCC-1937 cells.

圖1 各組乳腺癌細(xì)胞中Rab7a蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of Rab7a protein in breast cancer cells in various groups

2.2 慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞中熒光表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞感染慢病毒96 h后，陰性對照組和KD1、KD2、KD3及KD4組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，病毒感染率達(dá)到90%以上。見圖2(插頁三)。

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a基因敲除效率與陰性對照組比較， KD1組MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a mRNA表達(dá)水平下調(diào)了76.2%，即Rab7a基因敲除效率為76.2%；KD2組MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a mRNA表達(dá)水平下調(diào)了87.9%，KD3組MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a mRNA表達(dá)水平下調(diào)了86.2%，KD4組MDA-MB-231細(xì)胞中Rab7a mRNA表達(dá)水平下調(diào)了58.2%；與其他各組比較，KD2組細(xì)胞的靶序列具有最高的敲除效率(P<0.001)，即KD2組細(xì)胞的靶序列是敲除效率最高的靶點(diǎn)。見圖3。

*P<0.01 vs negative control group.

Fig.3 Expression levels of Rab7a mRNA in MDA-MB-231 cells in various groups

2.4 Rab7a基因敲除后的顯著性差異基因分布對Rab7a敲除效率最高的KD2組與陰性對照組進(jìn)行基因芯片檢測結(jié)果顯示:與陰性對照組比較，KD2組檢測的上調(diào)基因數(shù)(262個)增多(P<0.01)，下調(diào)基因數(shù)(372個)增多(P<0.01)。火山圖展示了與陰性對照組和KD2組差異基因分布情況。橫坐標(biāo)代表經(jīng)過以2為底對數(shù)轉(zhuǎn)換的差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表經(jīng)過以10為底對數(shù)轉(zhuǎn)換的矯正顯著性水平；紅色表示差異倍數(shù)大于1.5、顯著性水平小于0.05的所有探針。橫坐標(biāo)0左側(cè)代表下調(diào)的基因數(shù)，右側(cè)代表上調(diào)的基因數(shù)。見圖4(插頁三)。

2.5 差異基因相關(guān)疾病與功能關(guān)系對這634個差異基因進(jìn)行疾病與功能的IPA，疾病與功能柱狀圖展示差異基因在疾病與功能分類中的富集情況。所有疾病與功能使用-Log(Pvalue)值由高到底排序(即按照P值由小到大排序)。與陰性對照組比較，KD2組中與Rab7a相關(guān)聯(lián)的基因主要與癌癥、機(jī)體損傷和異常及細(xì)胞存活等有密切關(guān)聯(lián)。見圖5。

1:Cancer;2:Organismal injuries and abomalities;3:Cell death and survival;4:Cell growth;5:Protein synthesis;6:Cell-to-cell signaling and interaction;7:Cellular movement;8:Cellular development;9:Tumor morphology;10:Organismal survival;11:Gastrointestinal disease;12:Hematological system development and function;13:Immune cell trafficking;14:Hematological disease;15:Immunological disease.

圖5 差異基因相關(guān)疾病與功能關(guān)系的直條圖

Fig.5 Histogram of disease and function associated with different genes

2.6 指定基因IPA網(wǎng)絡(luò)圖根據(jù)指定基因VEGFA、IRS1、RPS6KB1、EIF4E和PRKAA1，添加目的基因Rab7a，通過IPA分析平臺繪制基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)圖中，Rab7a基因敲除導(dǎo)致eIF4F和IRS1表達(dá)下調(diào)以及激酶RPS6KB1表達(dá)下調(diào)；激酶PRKAA1和IKBKE表達(dá)上調(diào)及VEGFA和轉(zhuǎn)錄因子ATF2表達(dá)上調(diào)。見圖6。

3 討 論

圖6 指定基因的IPA網(wǎng)絡(luò)圖

乳腺癌已成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[9]，且死亡率持續(xù)升高[10],其中TNBC占浸潤性乳腺癌的10%～20%，嚴(yán)重影響女性健康與生活質(zhì)量[11]。由于TNBC不表達(dá)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，因此內(nèi)分泌治療及抗HER2分子靶向治療對TNBC患者無效[12]。目前有效的全身治療方法是具有細(xì)胞毒性的化療，這種治療方式不良反應(yīng)大且耐藥性高[13]。因此，探索TNBC發(fā)生變化的分子機(jī)制可能有助于深入了解這種疾病的治療策略[14]。

本課題組前期的研究[4]已經(jīng)證實(shí)：Rab7a在乳腺癌中發(fā)揮致癌基因的作用,促進(jìn)乳腺癌的生長和侵襲。本研究中采用重組的4 種不同靶序列的慢病毒敲除MDA-MB-231細(xì)胞的Rab7a基因，并成功獲得持久基因沉默、穩(wěn)定低表達(dá)Rab7a的MDA-MB-231 細(xì)胞。通過對不同靶點(diǎn)敲除效率的驗(yàn)證，篩選出Rab7a敲除效率最高的KD2組進(jìn)行基因芯片分析，結(jié)果顯示：與Rab7a敲除相關(guān)聯(lián)的基因有262個上調(diào)基因，372個下調(diào)基因。對差異基因進(jìn)行IPA分析可見Rab7a及其相關(guān)聯(lián)基因與癌癥、細(xì)胞存活、機(jī)體損傷和異常、炎癥、免疫反應(yīng)等有密切聯(lián)系，提示Rab7a及相關(guān)基因參與多種病理過程[15-18]。在指定的基因列表中，本研究通過添加目的基因Rab7a進(jìn)行IPA分析，在基因網(wǎng)絡(luò)分析圖中，Rab7a與指定各基因相互作用并發(fā)生變化。真核起始因子(eIFs)在腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用，mTOR/eIF4F軸有助于乳腺癌的維持和進(jìn)展[19]。本研究中，eIF4F被Rab7a敲除后表達(dá)下調(diào)，提示Rab7a可能通過調(diào)節(jié)eIF4F而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生。此外，Rab7a沉默還導(dǎo)致RPS6KB1表達(dá)降低，有研究[20]顯示：RPS6KB1在乳腺癌組織中發(fā)生了改變。本研究結(jié)果顯示：Rab7a耗竭增強(qiáng)了PRKAA1的表達(dá)。目前PRKAA1在癌癥發(fā)展中的作用尚不明確，PRKAA1和RPS6KB1在乳腺癌發(fā)展中的作用需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，可將TNBC細(xì)胞中Rab7a作為一個靶基因，對其相關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行IPA分析，全面預(yù)測Rab7a可能參與的疾病進(jìn)程，并將Rab7a與其相關(guān)基因進(jìn)行相互關(guān)聯(lián)分析，為將來更深層次的研究奠定基礎(chǔ)。