DNCB對BALB/c小鼠特應性皮炎的誘導作用及其機制

王欣欣，李思佳，關洪全，侯殿東

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110000；2. 遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院免疫與病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110000)

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于兒童，病程遷延，易復發(fā)。AD患者臨床癥狀主要表現為病變處皮膚干燥、瘙癢、濕疹和脫屑[1]。隨著工業(yè)化進程的加快和伴隨而來的環(huán)境污染，AD在全球范圍內的患病率呈現逐年升高的趨勢，兒童AD發(fā)病率高達10%～20%，成人AD發(fā)病率為1%～3%[2]。AD病因復雜，發(fā)病機制至今尚未明確[3]，而且缺乏有效的治療方法[4]，嚴重影響了患者的健康和生存質量[5-6]。為了闡明AD的病因和相關發(fā)病機制，進而提高該病防治水平，對AD進行更加深入的研究十分重要，有關AD的研究已成為當前皮膚科學及相關學科的研究熱點[7-8]。建立理想的動物模型是對疾病進行科學研究的基礎，小鼠基因圖譜與人類相近，遺傳背景明確，生長周期短，實驗可操控性強，常被作為模型動物復制人類疾病[9]。Nc/Nga小鼠是較為理想的AD模型小鼠品系，但是該種小鼠較為稀有，難于獲得。近交系BALB/c小鼠易于獲得，喂養(yǎng)條件要求低，亦為免疫性疾病常用的模型動物。近年來，國外有文獻[10-11]報道：以2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)作為半抗原外用致敏并激發(fā)BALB/c小鼠成功建立了AD小鼠模型。國內學者莫俊鑾等[12]對DNCB誘導AD小鼠模型的建立方法進行了探討。本研究參考相關文獻，調整了DNCB激發(fā)濃度并縮短致敏和激發(fā)時間，對DNCB誘導的AD小鼠造模方法進行改良，旨在為AD小鼠模型的研究提供科學依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器6～8周齡SPF級健康雌性BALB/c小鼠12只，體質量(20±2)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司,動物使用許可證號：SCXK(遼)2015-0001，動物合格證號：211002300028549。DNCB購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；抗白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)抗體(anti-IL-4)購自北京博奧森生物公司；基質溶液為丙酮和橄欖油按照4∶1的比例配制而成，用基質溶液為溶劑分別配制濃度為1.0%和0.5%DNCB溶液。全自助組織脫水機ASP6025和輪轉式切片機RM2235購自德國Leica公司，低溫高速離心機構自美國柯俊公司，酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 動物分組和給藥于SPF級實驗動物室分籠飼養(yǎng)，采用隨機數字表法分為2籠(對照組和AD模型組)，每籠6只。動物室內溫度為(24±2)℃，濕度為(50±10)%，保持12 h光照與12 h黑暗交替，小鼠食用標準飼料，隨意飲水進食。實驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周后，對所有小鼠背部皮膚組織進行除毛處理。于實驗第1、4、7天，采用1.0%DNCB(200 μL)溶液涂抹AD模型組小鼠背部皮膚組織進行致敏，每天1次，共涂抹3次，于實驗第14、17、19、22、24、27和29天分別采用0.5%DNCB(20 μL)溶液反復涂抹于小鼠左耳背部皮膚組織進行激發(fā)，每天1次，共涂抹7次。對照組小鼠于相同時間點涂抹等體積基質溶液。實驗第30天，采用1.2%三溴乙醇麻醉，眼眶取血后頸椎脫臼法處死小鼠，取左側耳部皮膚組織。

1.3 2組小鼠皮膚組織炎癥評分采用盲法對2組小鼠耳部皮損處炎癥嚴重程度進行評分。根據4種癥狀進行判定：干燥/脫屑，出血/紅疹，潰爛/表皮脫落，水腫。每種癥狀按照0(無)、1(輕度)、2(中度)和3(重度)進行評分，最終評分為4個癥狀相加之和，皮膚組織炎癥評分值為0～12分。

1.4 2組小鼠皮損處皮膚組織病理形態(tài)表現取所有小鼠的左耳皮膚組織均分為2份，加入10%中性甲醛固定，石蠟包埋(切面朝下)，制作5 μm厚切片，分別進行HE染色和甲苯胺藍染色。顯微鏡下觀察小鼠皮損處皮膚組織病理組織結構特點并檢測耳部皮膚組織上皮層厚度，每只小鼠取3張切片，放大200倍分別計數3個視野肥大細胞數，細胞數為3個視野細胞數的平均值。

1.5 免疫組織化學染色檢測2組小鼠皮損處皮膚組織中IL-4表達水平石蠟切片經梯度脫蠟復水處理后，0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液微波抗原修復15 min，PBS沖洗3次，3%H2O2室溫10 min，PBS沖洗3次， 5%BSA室溫15 min封閉內源性過氧化物酶，滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗，37℃、2 h，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染2 min，沖洗后樹膠封片。采用Image J軟件分析染色結果，以吸光度(A)值代表IL-4表達水平。

1.6 ELISA法檢測2組小鼠血清IgE水平2組小鼠眼眶取血放入含EDTA的抗凝管中，1 000 g離心10 min，取血清，參照ELISA試劑盒操作步驟檢測2組小鼠血清IgE水平。

2 結 果

2.1 2組小鼠皮膚組織炎癥評分AD模型組小鼠左耳部皮膚組織于第7天開始出現紅腫、變硬，第14天開始伴隨表皮干燥和脫屑，隨著實驗時間延長，激發(fā)次數增多，皮膚組織炎癥癥狀逐漸加重；對照組小鼠未見明顯皮膚組織炎癥改變。實驗第7、14、21和28天，與對照組比較，AD模型組小鼠左耳部皮膚組織炎癥評分明顯升高(P<0.01)。見圖1(插頁一)和表1。

表1 2組小鼠皮膚組織炎癥評分

GroupInflammation score(t/d) 7142128Control 0.167±0.4080.167±0.4080.333±0.5160.333±0.516AD model 2.500±1.048*5.000±1.414*6.667±1.862*8.833±1.722*

*P<0.01vscontrol group.

2.2 2組小鼠耳部皮膚組織上皮層厚度和浸潤肥大細胞數AD模型組小鼠左耳部皮損處皮膚表皮角化過度伴有角化不全，棘細胞層明顯增厚，輕度海綿形成，上皮層增粗下延，真皮淺層水腫，膠原纖維增生，大量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，血管擴張充血，毛囊增生。對照組小鼠耳部皮損處皮膚組織結構正常，層次清晰，未見血管擴張和炎細胞浸潤等典型炎癥反應。AD模型組小鼠耳部皮膚組織上皮層厚度[(46.67±4.46)μm]大于對照組[(10.00±2.61)μm](P<0.01)，2組小鼠耳部皮膚組織病理形態(tài)表現見圖2(插頁一)。 AD模型組小鼠肥大細胞計數[(64.17±11.09)個/HP]明顯高于對照組[(15.50±4.64)個/HP]，(P<0.01)，2組小鼠耳部皮膚組織肥大細胞浸潤表現見圖3(插頁一)。

2.3 2組小鼠皮損處皮膚組織中IL-4表達水平IL-4陽性染色定位于上皮細胞的胞漿中。與對照組(0.125±0.025)比較，AD模型組小鼠皮損處皮膚組織中IL-4表達水平(0.303±0.022)明顯升高(P<0.01)。見圖4(插頁一)。

2.4 2組小鼠血清IgE水平AD模型組小鼠血清IgE水平為(1 610.0±115.4)ng·L-1，對照組小鼠血清IgE水平為(364.2±41.7)ng·L-1，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前，用于復制人類AD的動物模型主要包括鼠模型系統(tǒng)和狗模型系統(tǒng)[13]，前者易于獲得，飼養(yǎng)簡單，操作方便，價格相對較低，因此在實驗中應用較多。成模方式有轉基因、變應原或化學物誘發(fā)等[14]。常用于AD模型的鼠品系主要有NC或Nga鼠、NOA鼠、BALB/c鼠和DS-Nh鼠等。國內外學者嘗試了多種AD鼠模型的建立方法，研究最多的是NC或Nga鼠，該鼠對X線及卵白蛋白高度敏感，在傳統(tǒng)飼養(yǎng)條件下可形成AD樣皮損，在皮膚科學界被認為是研究AD的理想模型動物，但該鼠品系特殊，在國內難于獲得。另有一些造模方法需要復雜的操作程序，也很難實現。因此探索通過簡單有效的方法建立合理的AD模型具有重要意義。

可用于誘導AD模型的抗原物質包括大分子卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、粉塵螨和半抗原等[15-16]?；瘜W制劑DNCB具有半抗原屬性，初次進入動物體內的DNCB可與上皮蛋白的可溶性部分共價結合，進而形成完全抗原，刺激機體淋巴細胞致敏。當致敏的淋巴細胞接觸到再次進入體內的DNCB時，便會引起過敏反應，因此可用于檢測細胞免疫功能。近年來，有學者采用DNCB成功制備AD小鼠模型，引起典型皮炎癥狀，伴隨血清IgE水平升高，表皮增厚，炎癥細胞浸潤增多，皮損處IL-4表達增多[17]。但不同研究選用動物的品系、性別、造模方案和DNCB的濃度選擇均存在差異。有研究[18-19]顯示：女性人群AD總體患病率高于男性。本研究不同于莫俊鑾等[12]的造模方法，選取雌性BALB/c小鼠作為模型動物，采用濃度為1.0%作為DNCB致敏濃度，0.5%作為DNCB激發(fā)濃度，縮短模型誘導時間，探討DNCB誘導建立AD小鼠模型的改良方法。

本研究結果顯示：實驗第7天，AD模型組小鼠開始出現輕微皮炎癥狀。自第14天激發(fā)開始，AD模型組小鼠皮炎癥狀逐漸加重，皮損處皮膚出現明顯增厚、紅腫、硬結，伴隨干燥和脫屑，小鼠皮炎癥狀隨著激發(fā)次數增多而逐漸加重。病理組織學觀察顯示：AD模型組小鼠皮損處上皮層明顯增厚，真皮層嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞數增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。上述結果從形態(tài)學角度證實了本研究造模方法的可行性。AD以Th2亞群功能亢進為特征，IL-4是Th2型細胞產生的關鍵細胞因子，在啟動AD發(fā)病和病程中均有重要作用，如刺激B細胞增殖并且合成IgE，刺激肥大細胞增殖并釋放組胺，促進T細胞增殖并且分化為Th2細胞等[20]。本研究結果顯示：AD模型組小鼠皮損處皮膚組織中IL-4表達水平明顯高于對照組。研究[21]證實：80%以上AD患者血清IgE水平高于健康人群，IgE水平升高程度與AD皮損嚴重程度和廣度基本平行。因此，血清IgE水平常被作為AD動物模型評價的重要指標之一。本研究采用ELISA法檢測了小鼠血清IgE水平結果顯示：AD模型組小鼠血清IgE水平明顯高于對照組。

綜上所述，本研究通過多種實驗方法證實了外用1.0%DNCB致敏BALB/c小鼠3次，后續(xù)外用0.5%DNCB多次激發(fā)，可成功模擬人類AD的疾病特點，建立AD小鼠模型；該模型動物品系易于獲得，操作過程簡單，復制性強，可作為深入研究AD病因、發(fā)病機制和防治手段的動物模型。