CCL23-CCR1趨化因子軸在上皮性卵巢癌疾病進(jìn)展中的作用

馮星浩，顏士杰，肖 蘭，魏兆蓮

卵巢癌(ovarian cancer，OC)最常見類型是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)。目前，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及鉑類聯(lián)合紫杉醇的系統(tǒng)化療是卵巢癌國內(nèi)外規(guī)范化治療的一線方案。因發(fā)病隱匿，70% EOC就診時(shí)已屬晚期，且易出現(xiàn)化療耐藥或復(fù)發(fā)。該研究通過抗體芯片，篩選出骨髓祖細(xì)胞抑制因子(myeloid progenitor inhibitory factor 1,MPIF-1)作為本研究的目的蛋白。MPIF-1又叫CCL23。研究表明外周血單核細(xì)胞中CCL23的表達(dá)水平與癌癥患者的進(jìn)展和存活相關(guān)，并通過構(gòu)建小鼠模型發(fā)現(xiàn)CCL23促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移前器官中的存活，有助于乳腺癌細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移集落的形成[1]。為明確CCL23在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的功能，該研究采用ELISA、免疫組化及qRT-PCR方法檢測上皮性卵巢癌患者血清CCL23濃度及原位病灶組織中的CCL23基因和蛋白表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 病例資料調(diào)取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2010年1月-2015年1月首次診斷為上皮性卵巢癌患者的石蠟切片，根據(jù)2014年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟卵巢癌分期標(biāo)準(zhǔn)(FIGO)進(jìn)行病理分期，選取其中Ⅰ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期40例，Ⅳ期20例，術(shù)前未接受新輔助化療或免疫治療，另取正常卵巢組織10例，漿液性卵巢瘤及交界性卵巢瘤，各20例，作為對照，其中正常卵巢組織來源于圍絕經(jīng)期因“子宮肌瘤”行子宮及雙側(cè)附件切除術(shù)的患者。

1.2 組織保存采用RNaFixer無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液保存卵巢組織。組織標(biāo)本入組標(biāo)準(zhǔn)：于該院首次診斷為上皮性卵巢癌患者，術(shù)前未接受新輔助化療或免疫治療，于手術(shù)日待手術(shù)標(biāo)本取下，使用PBS沖洗組織3次，洗去組織上的血液，迅速將新鮮組織剪成長、寬、高任意一邊厚度<0.5 cm浸泡入RNaFixer，新鮮組織浸泡于5倍體積的RNaFixer中，4 ℃過夜，后轉(zhuǎn)移至-20 ℃長期保存。樣品使用時(shí)可以在室溫融化，研磨勻漿進(jìn)行下一步RNA提取。

1.3 試劑TRIzol試劑購自美國InvitroGen公司；RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；RNaFixer無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液購自北京普魯頓生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自美國MyBioSource公司；通用型SP9000試劑盒購自福建邁新公司；細(xì)胞因子抗體芯片檢測試劑盒購自美國RayBiotech公司；化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒購自英國Amersham Phaimacia生物科技有限公司。

1.4 抗體芯片技術(shù)抗體蛋白質(zhì)檢測結(jié)果見圖1，操作過程按試劑盒說明書進(jìn)行并略作修飾。具體步驟為：將已包被抗體的蛋白質(zhì)芯片膜包被于BSA緩沖液室溫孵育30 min，以阻斷非特異性反應(yīng)，然后將膜與培養(yǎng)液于搖床上室溫孵育4 h,緩慢搖動(dòng)，使反應(yīng)均勻，充分洗膜，洗去非特異性結(jié)合物，加2 ml生物素結(jié)合的抗體，4 ℃孵育過夜，再次徹底洗膜，加辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈霉親和素，室溫孵育4 h，充分洗膜，使用化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒和UVP化學(xué)信號圖像系統(tǒng)顯色，照相，使用Ray Biotech INC抗體芯片分析工具軟件對所有原始數(shù)據(jù)(光點(diǎn)密度)根據(jù)單個(gè)膜陽性與陰性對照值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及減除背景處理，再進(jìn)行組間比較。

1.5ELISA采用ELISA檢測血清中CCL23的濃度。于手術(shù)日早晨取患者空腹血于抗凝管中，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液于無酶EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存，行ELISA前置于冰上解凍，渦旋混勻。標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)孔中加入10 μl血清樣本及40 μl樣本稀釋液毎孔中加入100 μl HRP試劑，37 ℃溫箱中孵育1 h，wash buffer清洗孔4次洗去非特異性結(jié)合，分別向毎孔中加入50 μl A顯色液和50 μl B顯色液，37 ℃溫箱中孵育15 min，毎孔中分別加入50 μl終止液，酶標(biāo)儀上立即測定450 nm處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔對應(yīng)血清CCL23濃度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCRTRIzol冰上裂解組織5 min，待組織及細(xì)胞充分溶解，加入200 μl氯仿，上下振搖EP管，冰上放置3 min后，4 ℃、7 500 r/min離心15 min后，取上層水相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)EP管中，加入500 μl異丙醇，充分混勻，冰上放置10 min,4 ℃、7 500 r/min離心10 min,去上清液，加入含DEPC的70%乙醇1 ml混勻洗滌后，4 ℃、3 125 r/min 離心10 min,重復(fù)洗滌3次，用DEPC水溶解RNA沉淀，立即測定RNA濃度和純度，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA等操作方法均嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進(jìn)行。CCL23基因引物序列(5′-3′)，上游：GCTGACTGCTGCATCTCCTACAC；下游：GGCTTGGAGCACTCGCTGTTC。內(nèi)參18S基因的引物序列(5′-3′)，上游：CATCTTCTTTTGCGTCGCCA；下游：TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC。PCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40次循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔct計(jì)算各目的基因mRNA的表達(dá)水平，其中Ct值為循環(huán)閾值。

1.7 免疫組化石蠟切片采用免疫組化SP法檢測蛋白表達(dá)水平。組織標(biāo)本切片置于65 ℃烤箱中烘烤1 h后，立即置于二甲苯中15 min，梯度乙醇脫水，PBS浸洗3次，室溫條件下0.3% Triton X-100通透30 min，行改良檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)20 min，待冷卻至室溫，使用3%過氧化物酶阻斷劑37 ℃封閉30 min，PBS浸洗3次，山羊血清37 ℃封閉1 h，輕輕甩去血清，一抗CCR1按1 ∶50稀釋，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，4 ℃過夜，PBS浸洗3次，二抗37 ℃孵育30 min后，PBS浸洗3次，三抗37 ℃孵育30 min，后DAB顯色，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)本研究組中組織標(biāo)本切片SP法檢測結(jié)果均有兩名本院資深病理科醫(yī)師閱片后判定。以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或者棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞，根據(jù)每份標(biāo)本中的陽性細(xì)胞所和染色強(qiáng)度所占百分比進(jìn)行評分及分組。CCR1豐度的半定量采用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行平均光密度值分析。按照癌細(xì)胞陽性細(xì)胞占比分為四個(gè)等級，其中高表達(dá)(癌細(xì)胞陽性表達(dá)占比>80%)；中度表達(dá)(癌細(xì)胞陽性表達(dá)占比40%～80%)；低表達(dá)(癌細(xì)胞陽性表達(dá)<40%)及陰性表達(dá)組。

2 結(jié)果

2.1 對照組和上皮性卵巢癌患者組血清中CCL23的濃度課題組前期通過對比4例成年正常女性血清和6例上皮性卵巢癌患者血清中441 種炎性因子表達(dá)水平，篩選出趨化因子CCL23差異表達(dá)；并進(jìn)一步在22例正常成年女性及36例上皮性卵巢癌患者血清中進(jìn)行驗(yàn)證，22例成年正常女性年齡40～63(53.80±8.20)歲，血清CCL23表達(dá)水平(1 157.80±457.40)pg/ml，36例上皮性卵巢癌患者年齡43～65(54.00±10.80)歲，血清CCL23表達(dá)水平(1 654.90±849.00)pg/ml。實(shí)驗(yàn)組患者年齡略高于正常對照組年齡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.095,P=0.925)。實(shí)驗(yàn)組血清CCL23水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.443，P=0.018 8)，見圖1。

2.2 對照組和上皮性卵巢癌患者組原位病灶中CCL23及CCR1的表達(dá)6例成年正常女性卵巢上皮組織中CCL23 mRNA表達(dá)水平(1.70±0.45)，6例上皮性卵巢癌患者原位病灶組織中CCL23 mRNA表達(dá)水平(12.99±2.88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.515,P=0.006)。此外，課題組通過免疫組化法證明CCR1在正常卵巢生發(fā)上皮(ovarian surface epithelial, OSE)呈陰性表達(dá)，見圖2。經(jīng)過光密度分析，在Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌石蠟切片中CCR1陽性表達(dá)較Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.403,P=0.000 6)。其中Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌共60例，平均光密度值(1.77±0.15)，Ⅰ/Ⅱ期共40例，平均光密度值(0.85±0.13)，見圖3。

圖1 趨化因子CCL23抗體芯片檢查結(jié)果1～4：正常對照組；5～10：上皮性卵巢癌組患者

3 討論

趨化因子家族是一個(gè)極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，促炎機(jī)制可用來有效解釋排卵次數(shù)增多、子宮內(nèi)膜異位癥、接觸滑石粉和石棉可增加卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn)。Trabert et al[2]在一項(xiàng)對前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌的巢式病例對照研究中，通過比較149例卵巢癌患者血清和149例對照組血清發(fā)現(xiàn)，急性C反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子IL-1α、IL-8、TNF-α，與卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。血清趨化因子水平也可能成為惡性腫瘤的敏感預(yù)后指標(biāo)之一。本課題組通過蛋白質(zhì)芯片工具對比4例成年正常女性血清和6例上皮性卵巢癌患者血清中441種炎性因子表達(dá)水平，篩選出趨化因子CCL23差異表達(dá)。并進(jìn)一步在22例成年正常女性及36例上皮性卵巢癌患者血清中進(jìn)行驗(yàn)證，提示上皮性卵巢癌組患者血清CCL23濃度明顯高于正常對照組，CCL23可能成為一種新的上皮性卵巢癌患者標(biāo)志物。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)和改善上皮性惡性腫瘤不良預(yù)后相關(guān)。Bronger et al[3]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CXCL9和CXCL10利于TILs在上皮性卵巢癌腫瘤內(nèi)的募集，從而發(fā)揮TILs的抑癌功能。K Au et al[4]在ID8同系小鼠高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer, HGSOC)模型中發(fā)現(xiàn)，CXCL10表達(dá)的增加可減少小鼠腫瘤負(fù)荷和惡性腹水量，而在ID8過表達(dá)CXCL10小鼠移植瘤模型中，腹水VEGF和IL-6水平明顯降低，CXCL10在HGSC腫瘤微環(huán)境中起著積極的作用。Rainczuk et al[5]在135例漿液性卵巢癌患者臨床樣本中發(fā)現(xiàn)，HGSOC可以表達(dá)CXCL10的拮抗物，干擾腫瘤中TILs的募集，從而導(dǎo)致患者的不良預(yù)后。Dangaj et al[6]研究表明，實(shí)體腫瘤來源的CCL5和經(jīng)髓細(xì)胞來源的IFN-γ誘導(dǎo)的CXCR3之間的相互作用，精細(xì)地調(diào)節(jié)TILs的浸潤過程。本課題組目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示上皮性卵巢癌病灶可能產(chǎn)生趨化因子，并且同時(shí)表達(dá)趨化因子受體，可能通過自分泌作用方式形成正反饋，從而直接參與腫瘤的發(fā)生及惡性生物學(xué)行為，但目前尚未建立可信的模型進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 免疫組化檢測正常對照組、漿液性囊腺瘤組、交界性腫瘤組中CCR1的表達(dá)

A：正常對照組；1、2中箭頭所示為正常OSE；1：200×視野圖例；2、3：400×視野圖例；B：漿液性囊腺瘤組；B2中箭頭所示為纖維結(jié)締組織內(nèi)襯漿液性單層柱狀上皮；C：交界性腫瘤組；C2中箭頭所示見漿液性上皮復(fù)層化；3：HE染色

腫瘤微環(huán)境中的趨化因子表達(dá)譜可改變癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，癌細(xì)胞能夠響應(yīng)趨化因子刺激。Ding et al[7]通過人群及體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以通過分泌CCL5，促進(jìn)胃癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移；越來越多的研究表明腹腔微環(huán)境與上皮性卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移相關(guān)。Lane et al[8]等使用ELISA檢測53例上皮性卵巢癌、24例卵巢良性腫瘤腹水，發(fā)現(xiàn)晚期漿液性卵巢癌腹水中CCL18水平明顯升高，并在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)癌性腹水和CCL18可以劑量依賴性的增加卵巢癌細(xì)胞系CaOV3和OVCAR3的轉(zhuǎn)移能力。Peng et al[9]證實(shí)腫瘤相關(guān)間皮細(xì)胞(cancer associated mesothelial, TAM)具有促腫瘤活性，并通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)通過誘導(dǎo)CAM的形成，CAFs釋放IL-8和CXCL5進(jìn)一步促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Zhao et al[10]通過免疫組化對比58例漿液性卵巢癌和25例卵巢正常上皮中CXCL14的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast, CAF)中高表達(dá)CXCL14與患者不良預(yù)后相關(guān)，在體外實(shí)驗(yàn)中，CAF高表達(dá)CXCL14，可上調(diào)長連非編碼RNA LINC00092, 從而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展。該研究使用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者組原位病灶組織中CCL23基因的表達(dá)水平明顯增高，提示該基因可能參與調(diào)控上皮性卵巢癌的進(jìn)展。為了解CCL23-CCR1在上皮性卵巢癌疾病進(jìn)展中的作用，課題組使用免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)正常OSE中CCR1呈陰性表達(dá)，而上皮性卵巢癌原位病灶組織中CCR1呈陽性表達(dá)，并且CCR1在Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌中的表達(dá)明顯高于Ⅰ/Ⅱ期，提示CCL23-CCR1趨化因子軸可能在上皮性卵巢癌疾病進(jìn)展中作用。但本研究并沒有證明趨化因子CCL23直接作用于受體CCR1，從而促進(jìn)上皮性卵巢癌的進(jìn)展，這些需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明。目前，關(guān)于CCL23基因過表達(dá)對上皮性卵巢癌的影響尚不明確，計(jì)劃后續(xù)繼續(xù)開展相應(yīng)功能試驗(yàn)，并對上皮性卵巢癌患者對應(yīng)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移病灶中CCL23的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)檢測，進(jìn)一步證明CCL23/CCR1軸在上皮性卵巢癌網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移中的作用。

A：200×視野圖例；B：400×視野圖例；C：400×HE染色圖例；1：Ⅰ期；2：Ⅱ期；3：Ⅲ期；4：Ⅳ期；D：各期別上皮性卵巢癌按照低、中、高表達(dá)分組后所占百分比圖例；E：半定量分析Ⅲ/Ⅳ期組織中CCR1表達(dá)；與Ⅰ/Ⅱ期比較：*P<0.05

綜上，趨化因子CCL23在上皮性卵巢癌患者和正常成年女性中存在差異表達(dá)，上皮性卵巢細(xì)胞可能通過自分泌作用形式形成正反饋，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。目前，CCL23基因作用機(jī)制的研究尚處于起始階段，其參與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及作用有待于進(jìn)一步探索。