過表達(dá)NDRG1通過調(diào)控VEGF/sFlt-1軸增強(qiáng)缺氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞的促血管形成能力

何宜靜，歐 瓊，李 婷，劉 玨

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種妊娠期特發(fā)性疾病，也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒病死率攀升的主要原因之一[1]。研究[2]證實(shí)，妊娠中晚期胎盤組織缺氧是PE的重要病理特征。N-myc下游調(diào)節(jié)基因1(N-myc downstream-regulated gene 1，NDRG1)是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可參與細(xì)胞增殖、分化、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、新血管形成以及各種應(yīng)激反應(yīng)[3]。有研究[4]顯示，缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞中NDRG1高表達(dá)，同時(shí)PE患者胎盤組織中NDRG1也呈現(xiàn)高表達(dá)[5]，但具體功能和作用機(jī)制不詳。但有報(bào)道稱[6]，PE患者血清和胎盤組織中可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)含量升高，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)含量降低，表明PE患者胎盤血管發(fā)育異常，推測(cè)NDRG1可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞促血管形成能力參與PE病理缺氧損傷的應(yīng)答調(diào)控。因此，現(xiàn)擬探討NDRG1過表達(dá)對(duì)缺氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞的促血管形成能力的影響，以明確NDRG1在PE發(fā)病的作用，為PE的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo(美國(guó)ATCC公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國(guó)HyClone公司)；NDRG1過表達(dá)(pCMV6-AC-NDRG1-GFP)及空載(pCMV6-AC-vector-GFP)慢病毒(2.0×108TU/ml)(上海HANBIO公司)；人源VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒、人源sFlt-1 ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上?？ㄅ锟萍加邢薰?；Transwell chamber(美國(guó)Corning公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；一步法qRT-PCR試劑盒(北京全式金)；兔抗人NDRG1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)單克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及感染 采用含5% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)期HTR-8/SVneo細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)至60%融合度時(shí)，分別取NDRG1過表達(dá)病毒(pCMV6-NDRG1)和陰性對(duì)照病毒(Vector)按照病毒感染比率值50 ∶1感染HTR-8/SVneo細(xì)胞，另選不做任何處理的HTR-8/SVneo細(xì)胞作為空白對(duì)照組，分別記為pCMV6-NDRG1組、Vector組和blank組。感染6～8 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)株。

1.2.2缺氧處理及分組 缺氧處理?xiàng)l件參考楊曉濤 等[7]等探索的最佳模擬PE體外細(xì)胞模型條件即1% O2培養(yǎng)24 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分為4組：① 空白對(duì)照組(blank)：采用常氧條件(21% O2+5% CO2+74% N2)培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞24 h；② 缺氧組(Hpx)：采用缺氧條件(1% O2+5% CO2+94% N2)培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞24 h；③Hpx+Vector組：采用缺氧條件培養(yǎng)感染陰性對(duì)照病毒的HTR-8/SVneo細(xì)胞24 h；④Hpx+pCMV6-NDRG1組：采用缺氧條件培養(yǎng)感染NDRG1過表達(dá)病毒的HTR-8/ SVneo細(xì)胞24 h。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中各基因mRNA表達(dá)水平 分組處理后收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA并測(cè)定濃度。取2 μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列：NDRG1 Forward：5′-CCAACCTCCCACCCCTGATACA-3′，Reverse：5′-CCACCCCGACAAGAGCAAAGAG-3′；sFlt-1 Forward：5′-ACAATCAGAGGTGAGCACTGCAA-3′，Reverse：5′-TCCGAGCCTGAAAGTTAGCAA-3′；VEGF Forward：5′-TGCAGATTATGCGGATCAAACC-3′，Reverse：5′-TGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG-3′；GAPDH Forward：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，Reverse：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性60 s、95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算NDRG1、sFlt-1和VEGF等mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF及sFlt-1蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(optical density，OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF和sFlt-1蛋白分泌量。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞沉淀，加入適量RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min 離心20 min，收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg蛋白采用沸水浴變性后上樣，通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入NDRG1抗體(1 ∶1 000)、MMP-2抗體(1 ∶1 000)、MMP-9抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入二抗(1 ∶10 000)室溫孵育30 min，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物，在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各孔條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值表示相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.2.6小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外促血管形成能力 取各組細(xì)胞，缺氧處理24 h后分別收集各組細(xì)胞上清液，1 500 r/min離心5 min，除去雜質(zhì)及死細(xì)胞，收集上清液備用。冰上溶解Matrigel基質(zhì)膠，鋪于96孔板中并置于培養(yǎng)箱中凝膠30 min。用上述各組上清液分別重懸HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，向鋪好基質(zhì)膠的96孔板中每孔加入150 μl細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞成管情況并拍照，并隨機(jī)取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)小管形成數(shù)量取均值。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 平鋪Matrigel基質(zhì)膠于Transwell上室制成凝膠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，上室接種200 μl細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含有20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，缺氧處理24 h后經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫室溫染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，選取5個(gè)隨機(jī)視野，統(tǒng)計(jì)視野中細(xì)胞數(shù)目，取平均值為侵襲的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞中NDRG1表達(dá)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與blank組比較，Hpx組細(xì)胞中NDRG1 mRNA表達(dá)水平升高(t=9.736，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細(xì)胞中NDRG1 mRNA表達(dá)水平也升高(F=391.323，P<0.001)。見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，與blank組比較，Hpx組細(xì)胞中NDRG1 蛋白表達(dá)水平升高(t=10.183，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細(xì)胞中NDRG1 蛋白表達(dá)水平也升高(F=76.333，P<0.05)。見圖1B。

圖1 各組細(xì)胞中NDRG1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

A: qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中NDRG1 mRNA表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中NDRG1蛋白表達(dá)水平；a：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：#P<0.05，###P<0.001

2.2 過表達(dá)NDRG1對(duì)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞中VEGF和sFlt-1表達(dá)的影響qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與blank組比較，缺氧處理后Hpx組細(xì)胞中VEGF和sFlt-1 mRNA水平均增加(t=39.792、33.130，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細(xì)胞中VEGF mRNA水平再次增加(F=967.729，P<0.001)，而sFlt-1 mRNA水平則降低(F=143.156，P<0.001)。見圖2A。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與blank組比較，缺氧處理后Hpx組細(xì)胞分泌的VEGF和sFlt-1蛋白水平升高(t=16.572、33.322，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細(xì)胞分泌的VEGF蛋白水平再次升高(F=290.098，P<0.001)，而分泌的sFlt-1 蛋白水平則降低(F=270.398，P<0.001)。見圖2B。

圖2 NDRG1過表達(dá)對(duì)缺氧后各組細(xì)胞VEGF和sFlt-1表達(dá)的影響

A: qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中VEGF和sFlt-1 mRNA表達(dá)水平；B：ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF和sFlt-1蛋白的表達(dá)水平；a：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+ pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

2.3 過表達(dá)NDRG1增強(qiáng)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞的促血管形成能力小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，blank組、Hpx組、Hpx+Vector組和Hpx+pCMV6-NDRG1組HUVEC細(xì)胞血管成管數(shù)量依次為(21.67±3.24)、(6.67±2.08)、(6.33±2.08)和(69.67±6.02)個(gè)，與blank組比較，缺氧處理后Hpx組細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞血管成管數(shù)量降低(t=6.784，P<0.05)；與Hpx組和Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞血管成管數(shù)量增加(F=266.007，P<0.001)。見圖3。

圖3 NDRG1過表達(dá)對(duì)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞促血管形成能力的影響 ×100

A：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

2.4 過表達(dá)NDRG1促進(jìn)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，blank組、Hpx組、Hpx+Vector組和Hpx+pCMV6-NDRG1組侵襲細(xì)胞數(shù)量依次為(154.34±8.50)、(55.69±9.61)、(57.67±6.11)和(447.33±22.01)個(gè)，與blank組比較，Hpx組侵襲細(xì)胞數(shù)目減少(t=13.183，P<0.05)；與Hpx組和Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組侵襲細(xì)胞數(shù)目增加(F=743.799，P<0.001)。見圖4。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，與blank組比較，Hpx組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白均顯著下調(diào)(t=23.799、21.257，P<0.01)；與Hpx組和Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白均顯著上調(diào)(F=314.440、197.271，P<0.001)。見圖5。

圖4 過表達(dá)NDRG1對(duì)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲的影響 ×200

A：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

3 討論

妊娠早期，滋養(yǎng)層細(xì)胞還沒完成對(duì)母體血管的侵入，胎盤的發(fā)育處于一個(gè)生理缺氧狀態(tài)，而這種局部缺氧可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、浸潤(rùn)及血管形成[8]。然而，待胎盤供血系統(tǒng)完全形成后滋養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)缺氧將會(huì)導(dǎo)致多種妊娠并發(fā)癥，例如妊娠期高血壓疾病。長(zhǎng)期以來胎盤缺氧被認(rèn)為是導(dǎo)致PE的關(guān)鍵因素，持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間缺氧可導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降[9]，而滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重塑障礙可誘發(fā)胎盤組織缺血缺氧，形成惡性循壞。此外，胎盤血管生成異常也是PE的重要病理特征，有研究[10]顯示，PE孕婦子宮螺旋動(dòng)脈血管阻力大小與胎盤血管新生呈正相關(guān)性。因此，通過增強(qiáng)胎盤血管形成能力或許能夠改善PE。本研究結(jié)果顯示，NDRG1過表達(dá)可以增強(qiáng)缺氧條件下HTR-8/ SVneo促血管形成能力，提示NDRG1可能作為預(yù)防和治療PE的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 過表達(dá)NDRG1對(duì)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白的影響

A：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：**P<0.01；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

NDRG1可表達(dá)于多種細(xì)胞，包括滋養(yǎng)層細(xì)胞，其功能復(fù)雜，且具有組織特異性。多項(xiàng)研究表明，NDRG1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，起到應(yīng)激損傷修復(fù)的作用，在胎盤發(fā)育及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)答應(yīng)激反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用。例如，Larkin et al[11]研究顯示，NDRG1缺失不利于胎兒生長(zhǎng)，并且會(huì)降低子宮對(duì)缺氧損傷的應(yīng)答能力。Chen et al[12]報(bào)道稱，缺氧能夠誘導(dǎo)NDRG1表達(dá)，沉默NDRG1表達(dá)能促進(jìn)缺氧應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果也證實(shí)，缺氧處理能夠誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞中NDRG1蛋白的表達(dá)。提示NDRG1在PE病理過程中可能扮演重要角色。

VEGF是重要的促血管生成因子，而其拮抗性受體sFlt-1則是主要的抗血管生成因子，二者的動(dòng)態(tài)平衡共同維持正常的血管形成過程。有研究[13]顯示，VEGF/ sFlt-1動(dòng)態(tài)失衡引起的血管功能障礙是導(dǎo)致PE發(fā)生的病理基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，缺氧處理24 h后HTR-8/SVneo細(xì)胞中VEGF和sFlt-1表達(dá)量均顯著升高，同時(shí)細(xì)胞的促血管形成能力和侵襲能力顯著降低。周瓊 等[14]研究也顯示，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境可以刺激滋養(yǎng)細(xì)胞TEV-1持續(xù)表達(dá)和分泌sFlt-1，而VEGF表達(dá)則隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，48 h達(dá)到峰值，與本研究結(jié)果相吻合。此外，缺氧處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞中VEGF與sFlt-1表達(dá)量均顯著增加，而細(xì)胞的促血管形成能力及侵襲能力則顯著降低，可能是由于缺氧刺激條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞中sFlt-1表達(dá)量急劇增加，導(dǎo)致sFlt-1瞬時(shí)表達(dá)量大于VEGF，打破了VEGF/ sFlt-1動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而表現(xiàn)出抗血管形成的作用。

為了進(jìn)一步探究NDRG1在滋養(yǎng)層細(xì)胞缺氧應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用，本研究通過感染NDRG1過表達(dá)慢病毒，建立NDRG1過表達(dá)的HTR-8/SVneo細(xì)胞系，再進(jìn)行缺氧處理。結(jié)果顯示，NDRG1過表達(dá)可顯著降低缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞中sFlt-1表達(dá)量，提高VEGF表達(dá)量，并提高HTR-8/SVneo細(xì)胞的促血管形成和侵襲能力。說明NDRG1過表達(dá)能夠促進(jìn)缺氧條件下HTR-8/SVneo細(xì)胞的促血管形成和侵襲能力。有研究[15]顯示，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)能夠靶向結(jié)合NDRG1啟動(dòng)子，調(diào)控NDRG1的轉(zhuǎn)錄，而HIF-1α是缺氧應(yīng)激反應(yīng)中的中樞調(diào)控因子，故缺氧可誘導(dǎo)NDRG1表達(dá)。此外，VEGF是HIF-1α下游的靶基因，因此NDRG1高表達(dá)可能通過介導(dǎo)VEGF表達(dá)，協(xié)調(diào)VEGF/ sFlt-1動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮促血管形成的作用。

綜上所述，NDRG1過表達(dá)可以促進(jìn)缺氧條件下人滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的促血管形成能力，其機(jī)制可能與介導(dǎo)VEGF/ sFlt-1動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，進(jìn)而在胎盤血管生成中起重要調(diào)節(jié)作用。因此，NDRG1有可能成為預(yù)防和治療PE的關(guān)鍵靶點(diǎn)。