CD147通過Wnt/β-catenin 途徑抑制前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇敏感性

方 芳， 徐海月，李 強(qiáng)，陳 爽，王立國

隨著生活方式的改變，我國前列腺癌(prostate cancer, PCa)的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1]。雄激素阻斷療法(androgen deprivation therapy, ADT)是中晚期PCa主要治療手段。然而，大多數(shù)患者在接受ADT治療2～3年內(nèi)由雄激素依賴性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer, ADPC)轉(zhuǎn)化為生存期短、易轉(zhuǎn)移和侵襲的去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)，中位生存期只有1～2年。多西紫杉醇(docetaxel, DOC)是治療CRPC的一線化療藥物，能有效提高患者生存率，但效果較短暫，極易產(chǎn)生耐藥，從而影響臨床治療的效果。因此，克服DOC的耐藥問題有望改善CRPC難治的現(xiàn)狀。

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular metalloproteinase inducer，EMMPRIN)，又稱CD147。CD147屬于跨膜免疫球蛋白超家族成員，過表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞表面。CD147參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等作用[2-3]。研究[4]表明，在化療藥物抵抗的腫瘤細(xì)胞中CD147表達(dá)增高。CD147表達(dá)陽性的腫瘤患者接受鉑類化合物治療后生存期短、預(yù)后差[5]。該研究旨在探討CD147在前列腺癌細(xì)胞DOC耐藥中的作用，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步研究，從而為逆轉(zhuǎn)PCa對(duì)DOC化療耐藥提供新的研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑人前列腺癌PC-3細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫；DOC和溴化四氮唑藍(lán)購自美國Sigma公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒和Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide, PI)凋亡檢測試劑盒購自南京碧云天生物有限公司；DMEM-F12培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal calf serum, FCS)購自美國Gibco公司；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、P 糖蛋白(P-glycolprotein,P-gp)和β-actin 抗體、Wnt 通路激活劑 LiCl 購自美國Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 低表達(dá) CD147 的實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞(PC-3/shCD147)和陰性對(duì)照組細(xì)胞PC-3細(xì)胞(PC-3/Scramble)由吉林醫(yī)藥學(xué)院抗體工程實(shí)驗(yàn)室保存[6]。細(xì)胞用 DMEM-F12 完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞IC50取對(duì)數(shù)生長期PC-3/Scramble細(xì)胞和PC-3/shCD147細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×1010/L，體積為200 μl，分別接種于96孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度(0、1、5和10 μmol /L) DOC培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，體外繼續(xù)培養(yǎng) 72 h。MTT 法測定吸光度( A) 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率(%) = (1-實(shí)驗(yàn)組平均A 值/對(duì)照組平均 A 值)×100%，計(jì)算各組細(xì)胞IC50值。

1.2.3Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡率 5 μmol/L DOC處理PC-3/Scramble和PC-3/shCD147細(xì)胞 24 h 后，胰酶消化收集細(xì)胞。用預(yù)冷無菌的PBS充分洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，加195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫、避光孵育10 min；加入10 μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，5 μmol/L DOC處理細(xì)胞 72 h 后。加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮器刮取細(xì)胞，4 ℃ 超聲裂解細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞核蛋白，收集上清液測蛋白濃度。取 30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上。室溫下PVDF 膜在封閉緩沖液中2 h，加兔抗β-catenin(1 ∶1 000)、P-gp(1 ∶1 000)和 β-actin抗體(1 ∶4 000)，4 ℃ 過夜。次日，TBST洗膜，分別加 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1 ∶5 000)室溫避光孵育 2 h。TBST洗膜，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 沉默CD147表達(dá)增強(qiáng)PC-3細(xì)胞對(duì)DOC的敏感性分別用1、5和10 μmol /L DOC作用細(xì)胞72 h后，MTT結(jié)果表明，與PC-3/Scramble細(xì)胞比較，DOC對(duì)PC-3/shCD147細(xì)胞的抑制率升高，并隨DOC濃度的增加而增高(F=11.28,P<0.05；F=397.15,P<0.01；F=60.69,P<0.01)(圖1)。計(jì)算DOC對(duì)PC-3/Scramble和PC-3/shCD147細(xì)胞IC50值。結(jié)果顯示，PC-3/Scramble細(xì)胞的IC50值 為(12.47±1.71)μmol/L，PC-3/shCD147細(xì)胞的IC50值為(2.38±0.13)μmol/L。提示CD147具有抑制PC-3細(xì)胞對(duì)DOC的敏感性作用。

2.2 沉默CD147表達(dá)促進(jìn)DOC干預(yù)的PC-3細(xì)胞凋亡通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用0或5 μmol/L DOC作用細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀對(duì)PC-3/Scramble和PC-3/shCD147細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測。結(jié)果顯示，與PC-3/Scramble組細(xì)胞比較，5 μmol/L DOC作用后CD147干擾組細(xì)胞凋亡率增高(F=111.26,P<0.01)(圖2)。提示CD147 能夠抑制PC-3細(xì)胞在DOC作用下的細(xì)胞凋亡。

圖1 沉默CD147增強(qiáng)DOC抑制的PC-3細(xì)胞生長作用

與PC-3/Scramble組比較：*P<0. 05，**P<0. 01

圖2 沉默CD147促進(jìn)DOC作用PC-3細(xì)胞凋亡

與5 μmol/L DOC作用PC-3/Scramble組比較：**P<0.01

2.3 CD147通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制DOC對(duì)PC-3細(xì)胞的敏感性采用0或5 μmol/L DOC作用細(xì)胞72 h，Western blot檢測PC-3/Scramble和PC-3/shCD147細(xì)胞β-catenin和P-gp的表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組PC-3/Scramble的β-catenin和P-gp的表達(dá)比較，PC-3/shCD147細(xì)胞中β-catenin和P-gp表達(dá)下降(F=73.83,P<0.01；F=10.97,P<0.05)；與5 μmol/L DOC作用PC-3/Scramble細(xì)胞比較，5 μmol/L DOC作用PC-3/shCD147細(xì)胞導(dǎo)致β-catenin和P-gp的表達(dá)顯著降低(F=159.05,P<0.01；F=110.47,P<0.01)；與PC-3/shCD147細(xì)胞比較，5 μmol/L DOC作用PC-3/shCD147細(xì)胞導(dǎo)致β-catenin和P-gp的表達(dá)降低(F=160.27,P<0.01；F=8.63,P<0.05)(圖3)。結(jié)果提示，CD147可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)途徑抑制PC-3細(xì)胞對(duì)DOC的敏感性作用。

圖3 沉默CD147抑制DOC作用PC-3細(xì)胞β-catenin和P-gp的表達(dá)

a: PC-3/Scramble組;b: PC-3/Scramble+DOC組;c: PC-3/shCD147組;d: PC-3/shCD147+DOC組;與PC-3/Scramble組比較:*P<0. 05,**P<0. 01; 與5 μmol/L DOC作用PC-3/Scramble細(xì)胞比較:##P<0. 01; 與PC-3/shCD147細(xì)胞比較:ΔP<0. 05,ΔΔP<0.01

為了進(jìn)一步證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與CD147降低PC-3細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。Wnt信號(hào)通路激活劑氯化鋰(LiCl) (10 μmol/L)作用5 μmol/L DOC干預(yù)的PC-3/shCD147細(xì)胞6 h，MTT、Western blot檢測結(jié)果顯示，PC-3/shCD147細(xì)胞抑制率為(50.4±4.16)%，LiCl干預(yù)PC-3/shCD147細(xì)胞組的抑制率為(28.7±3.9)%，兩組比較具有顯著差異(F=43.53,P<0.01)。與PC-3/shCD147細(xì)胞β-catenin和P-gp表達(dá)比較，LiCl干預(yù)的PC-3/shCD147細(xì)胞后β-catenin和P-gp的表達(dá)增加(F=43.14,P<0.01；F=95.45,P<0.01)(圖4)。

a: PC-3/shCD147組; b: LiCl組;c: PC-3/shCD147+LiCl組;與PC-3/Scramble細(xì)胞比較:**P<0. 01

3 討論

化療是治療CRPC的主要方法。自2004年美國食品及藥品管理局批準(zhǔn)DOC用于CRPC的治療，目前已成為CRPC的一線治療藥物，能有效提高患者的生存率。但藥物治療最大障礙之一是多數(shù)患者都會(huì)對(duì)DOC產(chǎn)生耐藥性，從而影響臨床治療效果。克服CRPC的耐藥問題，將改善CRPC的治療困境。研究[7-10]表明，DOC引起的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，包括凋亡信號(hào)通路的改變、微管蛋白的突變、銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)、P-gp和多藥耐藥相關(guān)蛋白等改變。以及PI3K/Akt、MAPK和Wnt/β-catenin多信號(hào)通路參與腫瘤的細(xì)胞耐藥[10-13]。P-gp是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的重要分子之一。研究[14]發(fā)現(xiàn)，在DOC耐藥的CRPC細(xì)胞 DU-145R中 P-gp 的表達(dá)水平明顯高于它們的親代細(xì)胞 DU-145，并且應(yīng)用P-gp 抑制劑能夠一定程度上逆轉(zhuǎn) DU-145R 細(xì)胞對(duì)DOC的耐藥性。在CRPC細(xì)胞PC-3中沉默P-gp的表達(dá)，PC-3細(xì)胞對(duì)DOC的敏感性明顯增強(qiáng)[14]。

CD147是在PCa細(xì)胞中高表達(dá)，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的重要分子。研究[15-16]表明，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸癌細(xì)胞中抑制CD147的表達(dá)能夠促進(jìn)對(duì)多西紫杉醇的藥物敏感性。并且我國學(xué)者已經(jīng)利用CD147單克隆抗體干預(yù)宮頸癌細(xì)胞后能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)紫杉醇的天然耐藥[16]。證實(shí)CD147可能是一個(gè)理想的能夠抑制細(xì)胞多西紫杉醇耐藥的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默CD147的表達(dá)能夠提高CRPC細(xì)胞PC-3對(duì)DOC的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡升高。課題組前期研究[17]表明，沉默CD147能夠抑制LNCaP細(xì)胞β-catenin轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。因此，本研究推測本課題組推測CD147可能夠通過Wnt/β-catenin途徑抑制PC-3細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在PC-3細(xì)胞中沉默CD147導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核中的表達(dá)同樣被降低，并且β-catenin的下游基因P-gp表達(dá)下降；DOC作用PC-3/shCD147細(xì)胞，導(dǎo)致β-catenin和P-gp表達(dá)進(jìn)一步下降。結(jié)果提示CD147可能通過Wnt/β-catenin途徑參與調(diào)解PC-3細(xì)胞對(duì)DOC的敏感性。為了進(jìn)一步探討CD147通過Wnt-β-catenin途徑抑制PC-3細(xì)胞對(duì)DOC敏感性，使用Wnt信號(hào)通路激活劑LiCl作用細(xì)胞。與PC-3/shCD147組比較，LiCl減弱了沉默CD147導(dǎo)致DOC作用的PC-3細(xì)胞存活率下降，促進(jìn)β-catenin和P-gp的表達(dá)。

綜上所述，CD147能夠?qū)е虑傲邢侔┘?xì)胞對(duì)DOC的敏感性降低，該作用可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。