miR-106a-5p靶向ERK2逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞MGC-803對(duì)順鉑化療的耐藥性

劉 耿，李永坤，劉洪鋒

胃癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，給社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而誘發(fā)胃癌的因素眾多，包括飲食、遺傳、幽門螺桿菌感染等，與年齡和性別也存在相關(guān)性，且由于前期隱匿性較強(qiáng)導(dǎo)致延誤治療[1]。目前，順鉑化療作為晚期胃癌的一線治療方案，在對(duì)患者的治療中體現(xiàn)出不同的治療效果，而這可能是由于癌組織中基因表達(dá)異常導(dǎo)致化療藥物耐藥性產(chǎn)生所造成的。有研究[2]顯示miRNA的異常表達(dá)可能是降低化療敏感性的重要原因。近年來(lái)，對(duì)miRNA的深入研究[3]顯示miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，可作為惡性腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物。miR-106a-5p作為miR-17家族的一員，被報(bào)道調(diào)控多種腫瘤和癌癥發(fā)生發(fā)展，如：腎細(xì)胞癌[4]、骨肉瘤[5]、星形細(xì)胞瘤[6]等。已有相關(guān)研究顯示，miR-106a-5p前體miR-106a可以逆轉(zhuǎn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)順鉑和吉非替尼的耐藥性[7]。而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)，包括ERK1和ERK2，是調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡和癌變的關(guān)鍵因子。現(xiàn)通過(guò)研究miR-106a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞中ERK2的表達(dá)以及對(duì)臨床胃癌順鉑化療的敏感性的影響，為臨床上癌癥的治療提供依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；人胃癌細(xì)胞系 MGC-803購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；順鉑(DDP)購(gòu)自美國(guó)Hospira公司；TRIzol Reagent、TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Lipofectamine? 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、hochest33342染料購(gòu)自北京索萊寶公司；E-鈣黏蛋白(E-Cadherin，E-Cad)、N-鈣黏蛋白(N-Cadherin，N-Cad)、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥株細(xì)胞的建立胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，傳代3次后用于后續(xù)試驗(yàn)。在胃癌細(xì)胞MGC-803生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)從低濃度DDP(0.5 mg/L)開(kāi)始誘導(dǎo)細(xì)胞，每2 d更換培養(yǎng)液，去除死亡細(xì)胞后待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定且再次達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期繼續(xù)傳代細(xì)胞，且增加25%的藥物濃度。持續(xù)誘導(dǎo)6個(gè)月后，以細(xì)胞能夠穩(wěn)定的存活于含高濃度(5 mg/L)的DDP培養(yǎng)液中且可以連續(xù)傳代培養(yǎng)，無(wú)細(xì)胞的明顯死亡后說(shuō)明順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP建立成功。耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP的培養(yǎng)方式與胃癌細(xì)胞MGC-803相同。

1.3 RT-PCR檢測(cè)將兩種細(xì)胞均以1×105個(gè)/孔培養(yǎng)于6孔板，待細(xì)胞貼壁，用PBS清洗細(xì)胞并提取總RNA，通過(guò)超微量核算蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度。用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒或Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物序列如下：miR-106a-5p正向：5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTA CAGTGCA-3′；miR-106a-5p反向：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；ERK2正向：5′-AGGCTGTTCCCAAATGCT-3′；ERK2反向：5′-CGTCACTCGGGTCGTAAT-3′。miR-106a-5p PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95 ℃、10 s，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。ERK2擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃、10 s，變性45 s，退火59 ℃、45 s，35個(gè)循環(huán)，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將MGC-803/DDP細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度培養(yǎng)于6孔板，待其生長(zhǎng)密度達(dá)到50%時(shí)才可用于轉(zhuǎn)染。操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑盒執(zhí)行即可，轉(zhuǎn)染8 h后將培養(yǎng)液更換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件PicTar、Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-106a-5p可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。構(gòu)建ERK2野生型(WT)和突變型(MUT)pGL3-熒光素酶報(bào)告載體。將耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP細(xì)胞分為WT組、MUT組、WT+miR-106a-5p mimics組和MUT+miR-106a-5p mimics組，培養(yǎng)于24孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，按分組情況分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性將ERK2構(gòu)建到pcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和pc-ERK2至耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP中，48 h后通過(guò)RT-PCR檢測(cè)ERK2表達(dá)情況，確認(rèn)過(guò)表達(dá)成功。分別轉(zhuǎn)染miR-106a-5p mimic和pc-ERK2至耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP，并分為Control(對(duì)照)組、mimic NC(陰性對(duì)照)組、miR-106a-5p mimic (miR-106a-5p高表達(dá)) 組、ERK2(ERK2高表達(dá))組和mimic+ERK2(共轉(zhuǎn)染)組。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度培養(yǎng)于96孔板，各組6個(gè)復(fù)孔。加入20 μmol/L 的DDP 5 μl處理細(xì)胞24 h，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。各孔加入100 μl Formanzan溶解液，孵育至紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。在570 nm測(cè)定吸光度。

1.7 EdU染色轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中加入20 μmol/L 的DDP 5 μl處理24 h，后續(xù)步驟按照EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。每孔加入50 μmol/L EdU 100 μl至培養(yǎng)基孵育2 h，PBS清洗細(xì)胞，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，棄去固定液；每孔加入甘氨酸中和固定液，PBS清洗；每孔加入100 μl滲透劑后孵育10 min；PBS清洗；每孔加入100 μl的1×Apollo染色液，孵育30 min，棄去染色反應(yīng)液；加入100 μl 0.5% Triton X-100清洗2～3次；每孔加入100 μl甲醇清洗后再PBS清洗。每孔加入100 μl 1× Hoechst 33342反應(yīng)液，孵育30 min后，PBS清洗；圖像獲取及分析。

1.8 Hochest33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡將MGC-803/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于有細(xì)胞爬片的6孔板，分組同上。分別將miR-106a mimics和pc-ERK2按分組轉(zhuǎn)染至MGC-803/DDP細(xì)胞，48 h后換液，除對(duì)照組外均加入DDP處理24 h。各孔棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞3次，加入hochest33342染液，于保溫箱中孵育30 min后棄去染液，PBS清洗3次，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右，熒光顯微鏡下檢測(cè)拍照。

1.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲將各轉(zhuǎn)染組胃癌細(xì)胞以1×105/ml密度，接種200 μl于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，下室加入600 μl含20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室未穿膜細(xì)胞，甲醇固定10 min，Giemsa染色30 min，鏡下隨機(jī)5個(gè)視野(1×100) 觀察結(jié)果并拍照、計(jì)數(shù)，取均值。

1.10 Western blot檢測(cè)將各轉(zhuǎn)染組胃癌細(xì)胞以1×105個(gè)/孔培養(yǎng)于6孔板，細(xì)胞貼壁后，DDP 處理24 h，用PBS清洗細(xì)胞，用含有PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行電泳，分別孵育相應(yīng)的一抗、二抗，加入BCL，進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 miR-106a-5p和ERK2在兩種細(xì)胞系中表達(dá)量的差異通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-106a-5p和ERK2在胃癌細(xì)胞株MGC-803和順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP中的表達(dá)差異。如圖1所示，以胃癌細(xì)胞株MGC-803為對(duì)照組，miR-106a-5p在順鉑耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)降低(t=10.31，P<0.05)，而ERK2 mRNA的表達(dá)上升(t=8.95，P<0.05)。由此可見(jiàn)，miR-106a-5p、ERK2在胃癌細(xì)胞株MGC-803和順鉑耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)量呈相反趨勢(shì)。

A：兩種細(xì)胞系中miR-106a-5p表達(dá)量；B：兩種細(xì)胞系中ERK1表達(dá)量；與MGC803比較:*P<0.05

2.2 miR-106a-5p靶向下調(diào)ERK2基因?qū)iR-106a-5p轉(zhuǎn)染到MGC-803/DDP細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-106a-5p的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，miR-106a-5p mimic轉(zhuǎn)染組中miR-106a-5p的表達(dá)量升高(t=21.14，P<0.05)，見(jiàn)圖2A。生物學(xué)預(yù)測(cè)miR-106a-5p與ERK2的靶向關(guān)系。ERK2基因序列上存在miR-106a-5p的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2B。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-106a-5p與ERK2的靶向關(guān)系。miR-106a-5p靶向下調(diào)ERK2的表達(dá)(t=5.38，P<0.05),見(jiàn)圖2C。由此可見(jiàn)，miR-106a-5p靶向作用于ERK2基因，且下調(diào)ERK2的表達(dá)量。

2.3 miR-106a-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)ERK2誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞活性增強(qiáng)與增殖將pc-ERK2轉(zhuǎn)染到MGC-803/DDP細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR確認(rèn)ERK2的過(guò)表達(dá)。ERK2組中ERK2的表達(dá)量高于對(duì)照組(t=18.22，P<0.05)，見(jiàn)圖3A。將miR-106a-5p mimic和pc-ERK2分別轉(zhuǎn)染到MGC-803/DDP細(xì)胞，經(jīng)20 μmol/L DDP處理后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。與對(duì)照組相比，miR-106a-5p mimic組的細(xì)胞活力下降(t=25.37，P<0.05)，而ERK2組細(xì)胞活力上升(t=9.32，P<0.05)，見(jiàn)圖3B。與ERK2組相比，mimci+ERK2組的活力下降(t=4.82，P<0.05)。通過(guò)EDU染色檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。與對(duì)照組(42±14)相比，miR-106a-5p mimic組(12±8)的細(xì)胞增殖數(shù)量下降(t=7.86，P<0.05)，而ERK2組(75±17)細(xì)胞增殖數(shù)量上升(t=13.66，P<0.05)。與ERK2組相比，mimic+ERK2組(51±12)細(xì)胞增殖數(shù)量下降(t=4.26，P<0.05)，見(jiàn)圖3C。由此可見(jiàn)，ERK2的高表達(dá)可以提高M(jìn)GC-803/DDP細(xì)胞在順鉑作用下的細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其增殖，而miR-106a-5p的高表達(dá)則可以逆轉(zhuǎn)ERK2高表達(dá)帶來(lái)的影響。

圖2 miR-106a-5p與ERK2基因的靶向關(guān)系

A：miR-106a-5p轉(zhuǎn)染效果；1：Control組；2：mimic NC組；3：miR-106a-5p mimic組；B：miR-106a-5p與ERK2基因靶向序列預(yù)測(cè)；C：熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向關(guān)系；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2 wt組比較：#P<0.05

2.4 miR-106a-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)ERK2誘導(dǎo)的MGC-803/DDP細(xì)胞凋亡減少通過(guò)hochest33342染色檢測(cè)各組MGC-803/DDP細(xì)胞凋亡情況。與對(duì)照組(3.9±2.0)相比，miR-106a-5p mimic組(42.4±6.8)細(xì)胞凋亡數(shù)量升高(t=17.02，P<0.05)，而ERK2組(2.0±1.7)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少(t=15.85，P<0.05)。見(jiàn)圖4。與ERK2組相比，mimic+ERK2組(10.2±4.2)中細(xì)胞凋亡數(shù)量上升(t=8.80，P<0.05)。由此可見(jiàn)，miR-106a-5p過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)ERK2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的MGC-803/DDP細(xì)胞凋亡水平降低。

圖3 MTT法和EDU染色法檢測(cè)胃癌細(xì)胞MGC-803/DDP的活力與增殖情況

A：pc-ERK2轉(zhuǎn)染效率；1：Control組；2：Vector組；3：ERK2組；B：MTT檢測(cè)不同濃度DDP處理下MGC-803/DDP細(xì)胞活力；C：EdU檢測(cè)MGC-803/DDP細(xì)胞增殖 ×400 ；1：Control組；2：mimic組；3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；D：EdU+陽(yáng)性細(xì)胞率；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

圖4 Hochest33342染色法檢測(cè)MGC-803/DDP細(xì)胞的凋亡情況

A：Hochest33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ×400；1：Control組；2：mimic組:3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；B：MGC-803/DDP細(xì)胞凋亡百分率；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

2.5 miR-106a-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)ERK2誘導(dǎo)的MGC-803/DDP細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)通過(guò)Transwell檢測(cè)各組MGC-803/DDP細(xì)胞侵襲力的改變。如圖5所示，與對(duì)照組(63±19)相比，miR-106a-5p mimic組(10±7)中細(xì)胞侵襲數(shù)量下降(t=9.09，P<0.05)，而ERK2組(159±39)中的細(xì)胞侵襲數(shù)量上升(t=15.49，P<0.05)。與ERK2轉(zhuǎn)染組相比，mimci+ERK2組(54±16)細(xì)胞侵襲數(shù)量下降(t=11.24，P<0.05)。由此可見(jiàn)，miR-106a-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了ERK2誘導(dǎo)的MGC-803/DDP細(xì)胞侵襲數(shù)量增加。

圖5 Transwell檢測(cè)MGC-803/DDP細(xì)胞的侵襲力

A：Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 ×400；1：Control組；2：mimic組；3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；B：MGC-803/DDP細(xì)胞侵襲數(shù)量；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

2.6 miR-106a-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)ERK2對(duì)EMT標(biāo)志性蛋白表達(dá)量的影響通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cad、N-cad蛋白的表達(dá)情況。如圖6A所示，與對(duì)照組相比，miR-106a-5p mimic組中E-cad表達(dá)量上升(t=9.45，P<0.05)，N-cad的表達(dá)量下降(t=13.24，P<0.05)；而ERK2組中E-cad表達(dá)量較對(duì)照組下降(t=24.88，P<0.05)，N-cad表達(dá)量上升(t=30.22，P<0.05)。與ERK2組相比，mimci+ERK2組中E-cad表達(dá)量上升(t=18.42，P<0.05)，而N-cad表達(dá)量下降(t=15.43，P<0.05)。由此可見(jiàn)，miR-106a-5p過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)ERK2過(guò)表達(dá)對(duì)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中標(biāo)志性蛋白表達(dá)量的影響。

圖6 Western blot檢測(cè)MGC-803/DDP細(xì)胞中E-cad、N-cad的蛋白表達(dá)量

A：Western blot檢測(cè)細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)量；B：Western blot檢測(cè)細(xì)胞N-cad蛋白表達(dá)量；1：Control組；2：mimic組；3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

3 討論

胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤疾病，目前臨床上對(duì)于胃癌的治療方案主要是采用鉑類化療藥物進(jìn)行治療[8]。但是隨著化療次數(shù)的增多，腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)鉑類化療藥物(包括順鉑)產(chǎn)生耐藥性，而腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制較為復(fù)雜，如靶點(diǎn)異常表達(dá)、藥物作用通路抑制、癌細(xì)胞對(duì)藥物的外排增強(qiáng)、DNA修復(fù)能力增強(qiáng)等。因此，逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥性將成為提高癌癥化療效果的關(guān)鍵。

ERK包括ERK1和ERK2，是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，磷酸化激活的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的癌變等多種生物學(xué)反應(yīng)，其中ERK2即MAPK1。miR-106a-5p是miR-106a 的剪切成熟體，參與著對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。近年來(lái)大量研究證實(shí)ERK在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。李登舉 等[9]發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制導(dǎo)致磷酸化ERK1和ERK 2蛋白質(zhì)低表達(dá)，并連續(xù)下調(diào)端粒酶活性，最終提高卵巢癌細(xì)胞COC1/DDP對(duì)DDP的敏感性。除此之外，Ye et al[10]發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者血清或NPC細(xì)胞中miR-106a-5p過(guò)表達(dá)，且參與下調(diào)MARK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑活性以改變細(xì)胞增殖和分化。因此推測(cè)，miR-106a-5p可以下調(diào)ERK2的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)MGC-803/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

為了證實(shí)我們推測(cè)，我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了miR-106a-5p和ERK2在胃癌細(xì)胞株MGC-803和順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，106a-5p和ERK2在胃癌細(xì)胞株MGC-803和順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP中的表達(dá)量均在負(fù)相關(guān)性。為了進(jìn)一步確定miR-106a-5p和ERK2存在靶向關(guān)系，本研究通過(guò)軟件分析預(yù)測(cè)了miR-106a-5p和ERK2存在的作用關(guān)系，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)確定了miR-106a-5p和ERK2存在靶向關(guān)系。

為了探明miR-106a-5p和ERK2在胃癌細(xì)胞耐藥性中的相互關(guān)系，本研究進(jìn)一步將miR-106a-5p mimic和pc-ERK2分別轉(zhuǎn)染至順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP中，并將DDP作用于實(shí)驗(yàn)組中各組細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞活性、增殖能力、凋亡水平以及侵襲能力的改變。研究結(jié)果顯示，miR-106a-5p可以靶向ERK2，降低DDP作用下順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP細(xì)胞活性，并誘導(dǎo)其凋亡水平的升高，同時(shí)降低其增殖能力和侵襲能力。研究結(jié)果表明，miR-106a-5p可以靶向ERK2，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性。

在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和與基底膜連接的粘附作用進(jìn)而轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞的過(guò)程稱為上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。大量研究顯示，EMT的過(guò)度活化在上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中起著增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力的關(guān)鍵作用[11]。細(xì)胞黏附因子E-cad表達(dá)下調(diào), 而N-cad表達(dá)上調(diào)是EMT過(guò)程中的標(biāo)志性特征[12-14]。有相關(guān)研究顯示，ERK的磷酸化和EMT的激活有助于增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3對(duì)DDP的抗性，而ERK的抑制劑PDK8059可以逆轉(zhuǎn)其耐藥性的產(chǎn)生[15]。本研究結(jié)果顯示，miR-106a-5p可以抑制ERK2誘導(dǎo)的E-cad低表達(dá)及N-cad的高表達(dá)，這表明，miR-106a-5p可以靶向ERK2而抑制EMT過(guò)程，降低胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

綜上所述，miR-106a-5p可以靶向抑制ERK2基因的表達(dá)，降低DDP作用下順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP細(xì)胞活性，并誘導(dǎo)其凋亡水平的升高，同時(shí)降低其增殖能力和侵襲能力，逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程，最終實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性。目前，關(guān)于 miRNA 在胃癌耐藥中的研究多見(jiàn)于細(xì)胞株，而其對(duì)胃癌患者化療耐藥的影響研究仍較少，因此后期我們將通過(guò)建立胃癌模型大鼠，觀察miR-106a-5p對(duì)大鼠順鉑化療效果的影響。