白介素-2及其受體在腎移植免疫耐受中對Fas/FasL的表達(dá)及T細(xì)胞凋亡的影響

曹榮華，石小紅

目前治療終末期腎病最有效的方法為腎移植，但接受移植后需長期服用免疫抑制劑，且并不能完全避免排斥反應(yīng)的發(fā)生[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是免疫治療中最有前景的一類細(xì)胞，這類細(xì)胞可以修復(fù)組織、調(diào)節(jié)免疫，在移植免疫耐受中受到廣泛應(yīng)用，但仍不能達(dá)到理想的耐受狀態(tài)[2-3]。白介素-2(interleukin-2,IL-2)是一種重要的調(diào)控免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子，IL-2發(fā)揮生物活性是通過與細(xì)胞表面的白介素-2受體(interleukin-2 receptor，IL-2R)結(jié)合，激活胞質(zhì)內(nèi)多種非受體型蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶(PTK)，通過Jak-STAT途徑控制基因轉(zhuǎn)錄、通過Ras-MAPK途徑控制細(xì)胞增殖、凋亡并通過調(diào)控PI3K途徑控制細(xì)胞骨架布局[4-6]。同時IL-2可以通過促進(jìn)Fas或/和FasL的表達(dá)通過促進(jìn)T細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，同時由于S期細(xì)胞易誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而達(dá)到促進(jìn)T細(xì)胞凋亡來調(diào)控免疫耐受。牛堅(jiān) 等[7]研究表明：白介素-10在受體在MSCs誘導(dǎo)肝移植免疫耐受中起重要作用。張黎黎 等[8]研究表明：大鼠腎移植時同時給予姜黃素與MSCs注射，可抑制免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)腎功能。目前有關(guān)IL-2和IL-2R在MSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受中的研究較少。該文旨在研究IL-2及IL-2R在MSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受中的影響，以期了解IL-2及IL-2R在MSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受中的作用機(jī)制，從而為MSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠各30只，體質(zhì)量20±20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2017-0022，分12個籠子飼養(yǎng)，每個籠子5只。飼養(yǎng)于本院動物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2藥物與試劑 sFas及sFasL ELISA試劑盒(貨號：YY40009)購自美國R&D公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；IL-2和TGF-β1(ELISA試劑盒)購自武漢賽默飛世爾科技有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；TRIzol提取試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 低溫高速離心購自德國Eppendorf公司；恒溫水浴箱購自天津泰新特儀器公司；超低溫冰箱購自昊昕儀器設(shè)備有限公司；Sysmex-chemix-180；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購自德國Leica公司；低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1建立模型 將小鼠麻醉后，腹主動脈插入灌注針，灌注含肝素鈉的腎保養(yǎng)液，分離出雙腎，置于4 ℃生理鹽水保存，將雙腎移植至腎臟已被切除的小鼠體內(nèi)，吻合血管。具體操作參考顧鳳娟等[9]研究。

1.2.2分組及藥物干預(yù) 30只免疫缺陷的BALB/c小鼠和30只C57BL/6 小鼠，隨機(jī)分為3組，分別為對照組、移植組和白介素-2組；每組2種小鼠各10只，分別為對照組、移植組和白介素-2組，對照組小鼠切下自身腎臟后在縫合消毒處理；移植組將 C57BL/6 小鼠腎臟移植給BALB/c小鼠縫合消毒處理，白介素-2組將 C57BL/6 小鼠腎臟移植給BALB/c小鼠，并將含有目的基因的MSCs細(xì)胞通過靜脈注入到移植受體中，其他2組注射等量生理鹽水。

1.2.3小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取脛骨和股骨，將骨髓腔無菌封閉狀態(tài)下置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡3 min，抽取4 ml DMEM培養(yǎng)液，穿刺入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓3～5次，收集至15 ml離心管，制成細(xì)胞懸液，使用恒溫離心機(jī)在1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液；用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×107個接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d換液1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶平底80～90%時進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞表面無CD29、CD34、CD45等抗原，注入小鼠之前使用免疫熒光染色鑒定其表面不存在這些抗原則表明培養(yǎng)3代后沒分化。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取小鼠MSC細(xì)胞，將目的基因單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。隨后將含IL-2 基因的DNA構(gòu)建到病毒載體中，轉(zhuǎn)染后48 h待病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄后形成mRNA，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑操作步驟進(jìn)行。

1.2.5實(shí)時定量PCR(RT-PCR)檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成24 h后采用實(shí)時熒光定量擴(kuò)增儀分別檢測細(xì)胞中IL-2 mRNA及IL-2R mRNA水平，TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。采用2-ΔΔCt法計(jì)算L-2mRNA及IL-2R mRNA的相對表達(dá)量，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6ELISA法檢測小鼠IL-2、TGF-β1、sFas及sFasL水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA)檢測小鼠IL-2、TGF-β1、sFas及sFasL水平，操作方法嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.7Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平 按照Western blot 檢測方法操作，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對JAK、STAT3、p-STAT3蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對定量分析。以目的蛋白條帶與 β-actin 灰度比值表示蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值為最終結(jié)果。

1.2.8小鼠生存期記錄 記錄小鼠生存時間：從造模成功后記為1 d，并開始記錄小鼠的生存時間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件和GraphPad Prism5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析作圖，生存期限比較采用Log-rank法檢驗(yàn)；計(jì)量指標(biāo)采用“均數(shù)±方差”表示，兩組間比較采用單因素方差分析,多組數(shù)據(jù)間比較采用重復(fù)測量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-2 mRNA及IL-2R mRNA表達(dá)水平相比對照組，移植組IL-2 mRNA及IL-2R mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與移植組相比，白介素-2組IL-2 mRNA及IL-2R mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 IL-2 mRNA及IL-2R mRNA表達(dá)水平

與對照組比較：**P<0.05；與移植組比較：##P<0.05

2.2 小鼠血液中IL-2、TGF-β1、sFas 及sFasL水平相比對照組，移植組IL-2、TGF-β1、sFas 及sFasL水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與移植組相比，白介素-2組IL-2、TGF-β1、sFas 及sFasL水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 小鼠血液中IL-2、TGF-β1、sFas 及sFasL水平

與對照組比較：**P<0.05；與移植組比較：##P<0.05

2.3 小鼠腎小管上皮細(xì)胞JAK、STAT3、p-STAT3表達(dá)情況相比對照組，移植組p-STAT3和JAK表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；STAT3表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；相比移植組，白介素-2組p-STAT3和JAK表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；STAT3表達(dá)無差異(P>0.05)，見圖1和表3。

圖1 小鼠腎小管上皮細(xì)胞JAK、STAT3、p-STAT3表達(dá)情況

表3 小鼠腎小管上皮細(xì)胞JAK、STAT3、p-STAT3表達(dá)情況

與對照組比較：**P<0.05；與移植組比較：##P<0.05

2.4 小鼠生存期記錄結(jié)果空白對照組分別在第8天和第35天有小鼠死亡，IL-2組在44 d時全部死亡，移植組小鼠60 d生存率提高至50%(5只死亡，5只存活)；相比IL-2，移植組小鼠60 d存活率提高，見圖2。

圖2 小鼠生存期記錄結(jié)果

3 討論

MSCs主要存在于骨髓組織中，這種干細(xì)胞具有自我更新、橫向分化和免疫調(diào)節(jié)功能。當(dāng)供體植入后會促進(jìn)T細(xì)胞使之表達(dá)Fas，而內(nèi)正常腎臟組織細(xì)胞無FasL表達(dá)，故會導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞對移植物的攻擊[10]。翟志敏[11]研究表明：IL-2是一種Th1型細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)。通過抑制Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞向Th1細(xì)胞遞呈抗原，進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞的增殖與分化實(shí)現(xiàn)抑制移植中的排斥反應(yīng)。不僅如此， IL-2可以通過促進(jìn)Fas和FasL的表達(dá)而促進(jìn)T細(xì)胞凋亡來調(diào)控免疫耐受。陳希煒 等[12]研究表明：IL-2是通過促進(jìn)T細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，同時S期細(xì)胞易誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)T細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)機(jī)體內(nèi)IL-2水平較高會刺激T細(xì)胞表達(dá)Fas、FasL，當(dāng)Fas、FasL水平升高后會T淋巴細(xì)胞對移植物的攻擊導(dǎo)致移植細(xì)胞的凋亡。

TGF-β1是腎臟的纖維化病變具有密切關(guān)系的細(xì)胞因子。TGF-β有共3種異構(gòu)體，在不同組織的分布具有特異性。TGF-β1在腎臟的表達(dá)最多，主要由腎小球和腎小管的上皮細(xì)胞分泌，是TGF-β家族中最具特征性的分子。TGF-β1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，不僅可以參與多個生物過程，抑制T細(xì)胞的活化與擴(kuò)增，同時也可維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)以及誘導(dǎo)自身耐受。TGF-β1具有較強(qiáng)的刺激纖維增生作用，促進(jìn)纖維細(xì)胞的生長。本研究中發(fā)現(xiàn)：白介素-2組小鼠TGF-β1水平較高。說明IL-2的高表達(dá)會促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，同時TGF-β1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與多個生物過程，特別是其過度表達(dá)與組織 纖維化密切相關(guān)，當(dāng)小鼠TGF-β1的表達(dá)增加促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，使得移植的腎臟出現(xiàn)排斥反應(yīng)。王平賢 等[13]研究表明：植腎患者中尿液中TGF-β1相對濃度高者腎功能差，與本研究得出的結(jié)論相一致。

Fas/FasL主要依靠介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡在移植免疫耐受中發(fā)揮重要作用。FasL也為TNF/NGF家族成員，不僅可以有效誘導(dǎo)Fas+T淋巴細(xì)胞凋亡也可與Fas特異性結(jié)合，產(chǎn)生死亡信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞凋亡。Fas/FasL水平越高，細(xì)胞凋亡率越高。FasL與Fas作用后細(xì)胞內(nèi)酪氨酸和絲/蘇氨酸的磷酸化，并促進(jìn)磷酸脂酶SMase活化，分解SM生成神經(jīng)酰胺，同時通過膜結(jié)合性的絲/蘇氨酸蛋白激酶和胞漿內(nèi)絲/蘇氨酸蛋白磷酸激酶導(dǎo)致IP3和DAG等第二信使的激活，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度升高并激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸酶，使得DNA斷裂且激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶使胞漿內(nèi)蛋白分子交聯(lián)最終而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)白介素-2組小鼠Fas/FasL水平升高，表明了移植的腎臟組織細(xì)胞凋亡程度較高、這可能和IL-2的表達(dá)激活了小鼠自身的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了對移植器官的排斥作用。這可能和Fas/FasL水平升高促進(jìn)T細(xì)胞凋亡增強(qiáng)了機(jī)體自身免疫功能相關(guān)。周文強(qiáng) 等[14]研究表明：Fas及FasL可能直接參與移植腎急性排斥反應(yīng)，F(xiàn)as及FasL水平越高排斥反應(yīng)越嚴(yán)重，與本研究得出的結(jié)論相一致。

在腎臟損傷中JAK激酶可以與其下游的STAT組成的信號通路會被激活，同時STAT3蛋白的也會通過酪氨酸磷酸化被異常激活，能夠誘導(dǎo)某些與免疫、細(xì)胞凋亡、炎癥等多種生理的關(guān)鍵基因產(chǎn)物的表達(dá)，通過各種途徑影響腎臟的功能。本研究發(fā)現(xiàn)：白介素-2組小鼠p-STAT3和JAK表達(dá)增加，說明高表達(dá)IL-2會促進(jìn)STAT3的磷酸化，促進(jìn)JAK/STAT3 信號降低腎移植中的免疫耐受。這可能是因?yàn)镴AK 激酶與其下游的STAT組成了重要的信號途徑，當(dāng)該通路被激活后，可以與TGF-β1結(jié)合，相當(dāng)于TGF-β1的啟動子，促進(jìn)了 TGF-β1的表達(dá)，使得腎臟纖維化，加重免疫排斥。李敏利 等[15]研究表明：IL-2可以通過影響 JAK/STAT3 信號通路發(fā)揮誘導(dǎo)免疫耐受的作用，與本研究得出的結(jié)論相一致。