MAIT細胞在結直腸癌患者外周血中頻率、表型及功能改變

邵春艷，朱 云，仲 飛，2，王 華，3，4

黏膜相關恒定T (mucosal-associated invariant T, MAIT) 細胞是一種類先天樣T淋巴細胞[1]，表達半恒定的T細胞受體 (T cell receptor, TCR)，其發(fā)育依賴于主要組織相容性復合體 (the major histocompatibility complex, MHC) Ib 類分子相關蛋白1 (MHC class I-related protein 1, MR1)[2]。該細胞可被維生素B代謝產(chǎn)物等激活[3]，活化后產(chǎn)生多種促炎及免疫調(diào)節(jié)細胞因子，間接調(diào)節(jié)著各種免疫，包括腫瘤免疫[4]。如MAIT細胞產(chǎn)生的IFN-γ可激活NK細胞、T細胞等，從而間接促進抗癌作用[5]。此外，其表面表達的C型凝集素NKG2D在腫瘤的免疫監(jiān)視中也同樣發(fā)揮著重要的作用[5]。

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤及腫瘤浸潤的淋巴細胞也有密切的關系[6]。MAIT細胞是近來廣受關注的一類免疫細胞，在臨床疾病中亦有研究[7]?，F(xiàn)選取結直腸癌患者，對其外周血循環(huán)MAIT細胞進行研究，探討結直腸癌患者與正常健康者對比，外周血MAIT細胞頻率、表型及功能的變化，化療前后MAIT細胞頻率有無改變，以及外周血MAIT細胞頻率與臨床腫瘤分期之間的關系。

1 材料與方法

1.1 外周血樣本的獲取樣本為肝素化人外周血約2 ml，取自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢中心的49例健康供者，年齡36～87 (58.40±1.76) 歲，排除肝腎心腦等重要器官疾病，排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤，及近期無發(fā)熱、無感染等病史的健康體檢者，和已確診的51例結直腸癌患者，年齡38～79 (60.17±1.68) 歲。

1.2 PBMC的制備將按等倍體積稀釋的人外周血樣本緩慢平鋪于4 ml的人外周血淋巴細胞分離液 (Ficoll液)上，以轉速2 000 r/min，25 ℃，30 min離心；巴氏吸管從已經(jīng)分層的樣本中，緩慢吸取云霧狀白膜層，即為單個核細胞層，并用1×PBS溶液洗滌2遍，即得PBMC。本研究已通過安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.3 主要試劑和儀器人系列單克隆熒光抗體 FITC-CD3(OKT3), PE-TCR/γδ(B1), APC- TCRVα7.2(3C10), Brilliant Violet 605-CD161(HP-3G10), Brilliant Violet 421-PD1(EH12.2H7), PE-CD69(FN50), APC/Cy7-Tim-3(F38-2E2), PE/Cy7-IFN-γ(B27), Brilliant Violet 421-TNF-α(MAb11). 所有流式抗體購自美國 Biolegend公司；Ficoll液(P8610) 購自北京Solarbio公司；PMA(P8139)、離子霉素(407951)購自美國Sigma公司；莫能霉素(420701)購自美國Biolegend公司；BD FACS流式細胞儀購自美國BD (Becton, Dickinson and Company)公司；檢測所得數(shù)據(jù)通過流式分析軟件FlowJo_V10進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 MAIT細胞頻率的檢測及數(shù)據(jù)獲取將制備好的PBMC用移液槍依次加入標記好的5 ml離心管內(nèi)，加入小鼠血清20 μl封閉細胞表面Fc段，防止非特異性結合；再按實驗方案加入預先制備的細胞表面檢測熒光抗體、同型對照熒光抗體及單染色熒光抗體，避光，置于4 ℃環(huán)境，30 min進行標記，最后用1×PBS溶液洗滌后上機檢測，并在檢測前用單染色管調(diào)整至最佳的檢測電壓及補償值。通過逐步圈門，計算出MAIT/CD3+T 細胞的比例 (%)；收集臨床血常規(guī)信息，進一步計算出每ml全血MAIT細胞的絕對數(shù) (×104/ml)。諸多關于MAIT細胞研究的報道，外周血MAIT細胞可定義為CD3+γδ-CD161++Vα7.2+ T細胞[6-8]，本文亦采取相同的圈門策略。

1.5 MAIT細胞功能檢測將制備好的PBMC用1×PBS溶液洗1遍，用完全培養(yǎng)基重懸后，依次加入24孔培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)孔體系控制在細胞數(shù)量1×106/ml，體積1ml；并向孔內(nèi)加入刺激劑PMA、離子霉素及蛋白轉運阻斷劑莫能霉素，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行4 h的細胞刺激。刺激完成后，依次進行細胞外染色、胞膜固定、破膜及細胞內(nèi)因子染色等步驟，最后以300 μl重懸液上機檢測。并注意在設門時，淋巴細胞群位置的變化。

2 結果

2.1 結直腸癌患者外周血MAIT細胞的頻率和絕對數(shù)降低如圖1 (A4)所圈出的即為MAIT細胞。圖1B為外周血MAIT細胞占CD3+T 細胞的比例以及全血中MAIT細胞絕對數(shù)在結直腸癌組及健康對照組之間的水平比較；流式結果顯示與健康對照組相比，結直腸癌患者外周血MAIT細胞的比例 (圖1B1，t=1.40±0.13/1.97±0.21，P=0.022)和絕對數(shù) (圖1B2，t=1.23±0.13/2.23±0.24，P<0.001)均降低。

2.2 化療因素對結直腸癌患者外周血MAIT細胞頻率的影響共8例患者，對同一患者化療前后共收集2次不同的血樣本，并進行MAIT細胞頻率的相關檢測。由圖可以看出，化療前后外周血MAIT細胞的頻率變化無統(tǒng)計學差異，即化療基本不影響結直腸癌患者外周血MAIT細胞頻率的變化 (圖2A：t=1.23±0.26/1.03±0.15，P=0.507；圖2B：t=0.28±0.06/0.26±0.04，P=0.743)。

圖1 流式細胞術對人外周血MAIT細胞的檢測及結直腸癌組與正常對照中MAIT細胞頻率的變化情況

A: 顯示MAIT細胞的圈門策略，將外周血MAIT細胞定義為CD3+γδ-CD161++Vα7.2+ T細胞；B:結直腸癌患者外周血MAIT細胞的變化情況；與健康對照組比較：*P<0.05,***P<0.001

圖2 化療前后外周血MAIT細胞的比例和絕對數(shù)的變化

A：MAIT/CD3+T 的比例；B：每ml全血MAIT細胞的絕對數(shù)(×104/ml)

2.3 結直腸癌患者MAIT細胞相關重要免疫表型的變化情況MAIT細胞表面存在多種表型，除常規(guī)的CD4、CD8等分子外，還有一些與腫瘤免疫密切相關的分子，如PD-1、Tim-3、CTLA-4等；另外，其活化性分子有CD69和CD38。本文，我們選取其中部分表面分子進行含量測定 (n=16/16)。結果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，結直腸癌患者外周血MAIT細胞表面的PD-1分子 (圖3B左，t=4.97±0.63/3.24±0.56，P=0.049) 和CD69分子 (圖3B中，t=27.83±2.40/14.07±1.88，P<0.001) 的測定是有差異的，但Tim-3分子(圖3B右，t=4.10±0.52/4.38±0.78，P=0.757) 無變化；即結直腸癌患者外周血PD-1+ MAIT、CD69+ MAIT比例是升高的，但Tim-3+ MAIT細胞比例無變化。

2.4 經(jīng)刺激活化后MAIT細胞功能的變化將制備好的PBMC用完全培養(yǎng)基重懸，加入24孔培養(yǎng)板，每孔加入PMA 0.5 μl、離子霉素1 μl和莫能霉素1 μl；再對刺激后的細胞進行胞膜固定、破膜處理，加入相應抗體；最后上機檢測。流式結果顯示與健康對照組相比，結直腸癌患者外周血MAIT細胞中IFN-γ+ MAIT細胞的水平 (圖4B左，t=51.69±7.29/58.12±7.38，P=0.545)和TNF-α+MAIT細胞的水平均無明顯變化(圖4B右，t=38.56±3.49/47.98±4.33，P=0.121)。說明結直腸癌患者外周血MAIT細胞的功能基本無改變。

圖3 兩組表面分子PD-1、CD69及Tim-3 的測定

A:陰性區(qū)的界線，與陽性區(qū)的圈門位置；B:兩組PD-1+、CD69+ 及Tim-3+ MAIT細胞的比例情況；與健康對照組比較：*P<0.05,***P<0.001

圖4 結直腸癌患者外周血MAIT細胞功能的測定

A:顯示圈門策略，縱、橫坐標陽性區(qū)分別表示IFN-γ+與TNF-α+ MAIT細胞的比例；B:分別顯示兩組MAIT細胞經(jīng)刺激后胞內(nèi)IFN-γ和TNF-α的表達水平

2.5 結直腸癌患者外周血MAIT細胞的頻率與其腫瘤分期之間的關系對于所收集的結直腸癌患者臨床腫瘤分期的數(shù)據(jù)，我們將其分組，并比較Ⅱ～Ⅲ期與Ⅳ期腫瘤患者外周血中MAIT細胞頻率和絕對數(shù)的差異。然而并無陽性結果 (圖5 A：t=1.64±0.24/1.32±0.16，P=0.261；圖5B：t=1.49±0.22/1.10±0.17，P=0.173)。腫瘤標志物在腫瘤的診斷及預后中也很有價值，根據(jù)其正常值范圍均將患者分為兩組，比較后發(fā)現(xiàn)差異也無統(tǒng)計學意義，見表1。

圖5 外周血MAIT細胞頻率與患者臨床腫瘤分期之間的關系

3 討論

MAIT細胞又是一類重要的免疫細胞，在人外周血中占1%～10%[4]，在腫瘤免疫中也扮演著重要的角色。我們想了解MAIT細胞在腫瘤免疫、腫瘤發(fā)生發(fā)展及腫瘤治療中的價值，故此我們初步探討了其最基本的生物學特性，即所呈現(xiàn)的頻率、表型及功能有無變化。本研究顯示：結直腸癌患者外周血MAIT細胞頻率與絕對數(shù)低于健康對照組，這與之前關于腫瘤患者外周血循環(huán)MAIT細胞頻率降低的研究結果相一致[9]。對于其重要表型的研究是本文一個新的研究思路，我們選取了T 細胞活化性表面標志分子CD69及免疫表型PD-1分子和Tim-3分子進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)其中PD-1分子和CD69分子的表面含量與對照組比是有變化的。但MAIT細胞在功能研究上卻無明顯差異，這可能是由于MAIT細胞的刺激實驗成功率較低，只有6～8例左右的數(shù)據(jù)，若增加樣本量可能還會呈現(xiàn)其他不同的結果。其次，化療前后，結直腸癌患者外周血MAIT細胞頻率與絕對數(shù)無變化，這與我們前期的另一項實驗胃癌中MAIT細胞的研究結論也較為一致，即化療不改變外周血MAIT細胞的頻率。最后，MAIT細胞頻率、絕對數(shù)與臨床腫瘤分期也無關聯(lián)，與腫瘤標志物CEA、CA19-9及CA72-4亦無關聯(lián)。

表1 臨床腫瘤標志物的水平與MAIT細胞外周血頻率之間的關系

本研究的不足之處是通過流式檢測對于人外周血MAIT細胞進行測定的研究方法過于單一。但研究方向、思路及內(nèi)容可為后續(xù)腫瘤免疫的研究提供一些幫助。另外，對于組織中MAIT細胞的研究、外周血MAIT細胞的純化、MAIT細胞與癌株的共培養(yǎng)實驗，以及細胞因子在腫瘤免疫中的具體調(diào)節(jié)機制的探索將會是一些很有價值的研究方向。