胰島素生長因子2甲基化對高糖誘導滋養(yǎng)層細胞凋亡及PI3K/Akt通路的影響

李 琴，謝瑩鶯

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是在妊娠期才首次出現(xiàn)或被確診的糖尿病，可使胎盤滋養(yǎng)層細胞持續(xù)處于高糖環(huán)境中，使其增殖活性降低進而影響胎盤功能，誘導胎盤組織發(fā)生明顯的體積、結構及血流灌注異常，增加畸胎、巨大兒、圍產(chǎn)期死亡、流產(chǎn)等的發(fā)生率，嚴重威脅胎兒及孕婦的健康[1-2]。研究[3]表明，胰島素生長因子2(insulin-like growth factor Ⅱ，IGF-Ⅱ)可調(diào)節(jié)機體合成代謝與細胞生長分化，在胎盤、胚胎早期發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，其表達水平低，會使胎盤、胚胎發(fā)育異常，引起流產(chǎn)。甲基化是在轉錄水平對基因的一種修飾方式，對基因表達及細胞正常分化具有重要作用，去甲基化可使基因的表達增強[4]，對葉酸缺乏孕鼠的研究[5]發(fā)現(xiàn)，胰島素生長因子系統(tǒng)的甲基化異常升高會影響胎鼠宮內(nèi)的生長發(fā)育，表明IGF-Ⅱ甲基化可影響IGF-Ⅱ蛋白表達，進而調(diào)控滋養(yǎng)層細胞增殖及凋亡，因而其甲基化可能影響高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡。PI3K/Akt通路在細胞生長、發(fā)育、凋亡等生理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[6]，可參與調(diào)節(jié)由牙齦卟啉單胞菌誘導的胚胎滋養(yǎng)層細胞的凋亡和炎癥過程，抑制PI3K/Akt通路活性，可促進細胞凋亡和炎癥因子的分泌[7]，但IGF-Ⅱ甲基化對PI3K/Akt通路的影響目前還不清楚。現(xiàn)通過高糖培養(yǎng)基誘導滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo凋亡，探究IGF-Ⅱ甲基化對高糖誘導滋養(yǎng)層細胞凋亡及PI3K/Akt通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo(貨號：HTX-1923)(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；IGF-Ⅱ甲基化引物、IGF-Ⅱ非甲基化引物、IGF-Ⅱ nMS-PCR外側引物(上海生工生物工程股份有限公司)；5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc，貨號：A119533)(上海恒斐生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號：31800)、胎牛血清(FBS，貨號：11011-8611)、青鏈霉素混合液(貨號：P1400)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(貨號：P1200-50T)、PBS緩沖液(貨號：P1022)、胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號：T1300)、D-葡萄糖粉(貨號：G8150)(美國Solarbio公司)；CpGenome DNA修飾試劑盒(貨號：S7820)(美國Intergen公司)；基因組DNA提取試劑盒(貨號：YY-62019)(上海優(yōu)予生物科技有限公司)；TaKaRa LA Taq? with GC Buffer(貨號：RR02AG)(日本TaKaRa公司)；瓊脂糖(貨號：A3381)(上海士鋒生物科技有限公司)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號：V13242)、兔源GAPDH(貨號：PA5-85082)、IGF-Ⅱ(貨號：ab9574)、PI3K(貨號：710400)、Akt(貨號：44-609G)、p-Akt(貨號：44-621G)、Bax(貨號：PA5-11378)、caspase3(貨號：PA5-86276)一抗，鼠源Bcl-2(貨號：13-8800)一抗，羊抗鼠二抗(貨號：A-11029)，羊抗兔二抗(貨號：A-11034)(美國Cell Singaling Technology公司)；蛋白裂解液(貨號：P0013K)、CKK-8試劑盒(貨號：C0037)、BCA試劑盒(貨號：P0011)、96孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶、60 mm培養(yǎng)皿(上海碧云天公司)等。

1.1.2儀器 酶標儀(Model 680)、小型垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；PCR擴增儀(PC808)(美國Astec公司)；流式細胞儀(CytoFLEX, 美國貝克曼庫爾特公司)；雙人單面超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；高速離心機(Biofuge 28RS)(德國Heraeus)；制冰機(XB-70,美國 GRANT 制冰機公司)；恒溫水浴鍋(上海析達儀器有限公司生產(chǎn))等。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組處理 細胞完全培養(yǎng)基的配制：向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10% FBS、1%青鏈霉素混合液，上下顛倒，混合均勻。細胞高糖培養(yǎng)基的配制：參照文獻[8]，向細胞完全培養(yǎng)基(根據(jù)說明書可知葡萄糖終濃度為11.11 mmol/L)中加入D-葡萄糖粉，使培養(yǎng)基中葡萄糖終濃度為50 mmol/L。

購買的凍存細胞，在39 ℃左右水浴中快速融化，3 000 r/min，室溫離心5 min，向細胞沉淀中加入5 ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞長至85%左右時，胰酶消化后以1 ∶3的比例進行傳代培養(yǎng)。

使用RPMI-1640培養(yǎng)基將5-aza-dc配制為50 mmol/L 的儲備液備用。傳代培養(yǎng)的細胞長至80%以上時，胰酶消化后接種于60 mm培養(yǎng)皿中，隨機分為對照組、高糖組、5-aza-dc+高糖組，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，高糖組、5-aza-dc+高糖組將培養(yǎng)基更換為高糖培養(yǎng)基，5-aza-dc+高糖組細胞加入5-aza-dc儲備液，使終濃度為20 μmol/L[9]，對照組細胞不做處理，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集各組細胞。

1.2.2巢式甲基化特異性聚合酶鏈式反應(nested methylation specific PCR，nMS-PCR)檢測IGF-Ⅱ甲基化水平 將收集的各組細胞，參照文獻[10]的方法，使用基因組DNA提取試劑盒提取各組細胞的基因組DNA，取各組細胞的基因組DNA樣品約1 μg，采用CpGenomeDNA修飾試劑盒對DNA進行亞硫酸氫鈉修飾后得到進行PCR反應的模板DNA，操作步驟分別參照各自說明書，以得到的亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA為模板，IGF-Ⅱ甲基化引物、IGF-Ⅱ非甲基化引物共同的nMS-PCR外側引物P3為反應引物進行PCR擴增反應，再以PCR產(chǎn)物為模板，分別用IGF-Ⅱ甲基化引物P3M、IGF-Ⅱ非甲基化引物P3U為反應引物進行PCR擴增反應，反應條件的設定、反映體系的配制依照說明書進行，最終得到的IGF-Ⅱ甲基化、非甲基化PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及甲基化條帶的吸光度，計算甲基化水平，公式為：甲基化水平=甲基化吸光度(optical density，OD)值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3細胞增殖、凋亡情況檢測 細胞增殖檢測：傳代培養(yǎng)的細胞長至80%以上時，胰酶消化后計數(shù)，以5×105個/ml濃度接種在96孔板中，隨機分為對照組、高糖組、5-aza-dc+高糖組，每組設4個孔，參照1.2.1項中處理細胞的步驟分別處理細胞，48 h后每孔中加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用全自動酶標儀測定450 nm波長下各孔OD，計算各組細胞的相對存活率，公式為：相對存活率(%)=藥物處理組OD值/對照組OD值×100%。

細胞凋亡檢測：1.2.1中收集的各組細胞分別加入完全培養(yǎng)基后，吹打均勻后計數(shù)，取含有約1×106個細胞的細胞混懸液到一個5 ml離心管中，1 000 r/min，室溫離心5 min，細胞沉淀以PBS溶液漂洗2次后，加入200 μl的Binding Buffer及10 μl的ArmexinV-FITC輕輕震蕩混勻，室溫，避光反應15 min，再加入300 μl的Binding Buffer及5 μl PI震蕩混勻，繼續(xù)室溫，避光反應15 min，1 000 r/min，室溫離心5 min，細胞沉淀以PBS溶液漂洗2次后，加入PBS溶液混勻，在流式細胞儀中檢測細胞凋亡情況。

1.2.4Western blot法檢測蛋白表達水平 1.2.1中收集的各組細胞加入蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，使用BCA試劑盒并參照說明書的步驟測定總蛋白濃度，根據(jù)結果調(diào)整各組蛋白使?jié)舛认嗤?，采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒配制SDS-PAGE濃縮膠及分離膠，各組分比例及配制方法參照說明書，取20 μg總蛋白在垂直電泳儀中進行電泳并轉移分離的蛋白至PVDF膜上，根據(jù)目的蛋白分子量截取相應的條帶分別置于小盒中，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，加入1 ∶1 000的兔源GAPDH、IGF-Ⅱ、PI3K、Akt、p-Akt、Bax、caspase3一抗，鼠源Bcl-2一抗，4 ℃孵育過夜，TBST溶液漂洗3次，加入1 ∶2 000的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST溶液漂洗3次，以ECL顯色，在凝膠成像儀中觀察蛋白條帶并分析其相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞IGF-Ⅱ甲基化及蛋白表達水平的比較對照組、高糖組、5-aza-dc+高糖組細胞甲基化水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=24.857)；三組間蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=86.135)。其中與對照組相比，高糖組細胞IGF-Ⅱ甲基化水平升高(P<0.05)，IGF-Ⅱ的蛋白水平降低(P<0.05)；與高糖組相比，5-aza-dc+高糖組細胞IGF-Ⅱ甲基化水平降低(P<0.05)，IGF-Ⅱ的蛋白水平升高(P<0.05)。見圖1。

2.2 IGF-Ⅱ甲基化對細胞增殖的影響對照組、高糖組、5-aza-dc+高糖組細胞相對存活率分別為(100.00±0.00)%、(57.61±11.01)%、(82.60±15.02)%(F=47.128)。其中與對照組相比，高糖組細胞相對存活率明顯降低(P<0.05)；與高糖組相比，5-aza-dc+高糖組細胞相對存活率升高(P<0.05)。

2.3 IGF-Ⅱ甲基化對細胞凋亡的影響對照組、高糖組、5-aza-dc +高糖組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=49.796)。其中與對照組相比，高糖組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與高糖組相比，5-aza-dc+高糖組細胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖2。

2.4 IGF-Ⅱ甲基化對細胞凋亡相關蛋白表達的影響對照組、高糖組、5-aza-dc+高糖組細胞Bcl-2蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=314.900)；Bax蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=431.232)；caspase-3蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=220.667)。其中與對照組相比，高糖組細胞Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bax、caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與高糖組相比，5-aza-dc+高糖組細胞Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，Bax、caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組細胞IGF-Ⅱ的甲基化水平及蛋白水平

A：各組細胞IGF-Ⅱ的甲基化水平；M：IGF-Ⅱ的甲基化產(chǎn)物；U：IGF-Ⅱ的非甲基化產(chǎn)物；B：各組細胞IGF-Ⅱ的蛋白水平; a：對照組；b：高糖組；c：5-aza-dc+高糖組；與對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：##P<0.05

圖2 各組細胞凋亡情況

圖3 各組細胞凋亡相關蛋白表達

A：對照組；b：高糖組；c：5-aza-dc+高糖組；與對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：##P<0.05

2.5 IGF-Ⅱ甲基化對細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達的影響對照組、高糖組、5-aza-dc+高糖組細胞p-PI3K蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=110.576)；p-Akt蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=58.469)。其中與對照組相比，高糖組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯降低(P<0.05)，PI3K、Akt蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與高糖組相比，5-aza-dc + 高糖組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高(P<0.05)，PI3K、Akt蛋白表達無明顯變化(P>0.05)。見圖4。

3 討論

胎盤是母親與胎兒進行營養(yǎng)物質交換的重要樞紐，是妊娠建立的基礎，而胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖活性對胎盤組織的形成、發(fā)展及胎兒的生長發(fā)育至關重要，其在妊娠早期向子宮內(nèi)膜的侵襲確保了胚胎的著床植入及營養(yǎng)物質的傳遞，保證了胎盤正常功能和妊娠的順利進展，而滋養(yǎng)層細胞增殖活性在妊娠早期受抑制可導致胎盤發(fā)育不良，誘發(fā)流產(chǎn)，在妊娠中晚期受抑制則會造成胎兒營養(yǎng)物質供應不足，引起胎兒慢性宮內(nèi)缺氧及生長發(fā)育遲緩[11]。GDM使胎盤滋養(yǎng)層細胞持續(xù)處于高糖環(huán)境中，降低其增殖及侵襲活性，損害胎盤功能，導致早期流產(chǎn)、胎盤形成不良、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩與畸形等嚴重后果[12]，因此關于高糖引起的滋養(yǎng)層細胞凋亡的預防及作用機制的研究具有重要的臨床意義。研究[13]發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅱ可促進滋養(yǎng)層細胞中PKB和P70S6K蛋白表達，進而促進滋養(yǎng)層細胞增殖，維持胎盤的正常發(fā)育，而IGF-Ⅱ甲基化異常增高，可抑制IGF-Ⅱ表達，引起胚胎停育[14]，因此IGF-Ⅱ的甲基化可能影響高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡。本文研究結果顯示，與對照組相比，高糖組細胞相對存活率、IGF-Ⅱ蛋白表達明顯降低，IGF-Ⅱ甲基化水平、細胞凋亡率明顯升高；與高糖組相比，5-aza-dc+高糖組細胞相對存活率、IGF-Ⅱ蛋白表達升高，IGF-Ⅱ甲基化水平、細胞凋亡率降低，表明在高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡過程中，IGF-Ⅱ甲基化水平升高，IGF-Ⅱ蛋白表達降低，而以5-aza-dc降低其甲基化水平后，可促進IGF-Ⅱ蛋白表達，抑制滋養(yǎng)層細胞凋亡，增強滋養(yǎng)層細胞增殖活力，揭示IGF-Ⅱ甲基化可促進高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡，抑制IGF-Ⅱ甲基化可抑制其凋亡。

圖4 各組細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達

a：對照組；b：高糖組；c：5-aza-dc+高糖組；與對照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：##P<0.05

細胞凋亡是細胞的一種自主、有序的死亡過程，多種基因及蛋白參與其中，caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用，細胞中抑凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax表達量的比值在細胞凋亡的調(diào)節(jié)中具有關鍵作用[15]。在尤文肉瘤的研究[15]中發(fā)現(xiàn)，miR-30d可通過下調(diào)PI3K/Akt通路抑制Bcl-2表達，促進caspase-3、Bax表達，進而增強尤文肉瘤凋亡。肖艷平 等[16]發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可激活PI3K/Akt/mTOR信號，提高人滋養(yǎng)層細胞HTR-8/Svneo增殖和侵襲能力，因此激活PI3K/Akt信號可能是IGF-Ⅱ低甲基化抑制高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡的作用機制。本研究結果顯示，與對照組相比，高糖組細胞Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯降低，Bax、caspase-3蛋白表達明顯升高，PI3K、Akt蛋白表達無明顯變化；與高糖組相比，5-aza-dc+高糖組細胞Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高，Bax、caspase-3蛋白表達降低，PI3K、Akt蛋白表達無明顯變化，表明在高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡過程中，PI3K/Akt通路被抑制，而激活PI3K/Akt通路，滋養(yǎng)層細胞凋亡減少，增殖增強，揭示PI3K/Akt信號可能是IGF-Ⅱ甲基化調(diào)節(jié)高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡的作用靶點，降低IGF-Ⅱ甲基化水平可能通過激活PI3K/Akt信號抑制高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡。