Src在氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用

李森 楊克 王艷萍 李海清 劉震杰 王堅 高志偉 潘以鋒 何敏志 陳兵

平滑肌細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［1］。血管平滑肌細(xì)胞受病理刺激時可發(fā)生表型變化，即收縮型表型向合成型表型的轉(zhuǎn)變［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox LDL）可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化等病理變化，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生［3］，但ox LDL調(diào)控平滑肌細(xì)胞的分子機(jī)制仍不清楚。本研究擬探討非受體蛋白酪氨酸激酶（PTK）家族成員Src激酶對ox LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

C57BL/6小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，ox LDL 購自英國Serotec公司；Src小干擾RNA（siRNA）購自美國SMARTpoolTM公司；PP2（Src抑制劑）、PP3（PP2的陰性對照）購自美國CalBiochem公司；抗β-肌動蛋白抗體、抗Src抗體（Y-416）抗體、抗Src抗體、抗肌球蛋白重鏈11（MYH11）抗體及抗CD68抗體購自美國Abcam 公司；細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基及試劑購自美國Gibco公司；總RNA 抽提、cDNA逆轉(zhuǎn)錄及Western blot檢測試劑盒均購自中國碧云天公司；實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）檢測用試劑購自中國天根生物科技有限公司，檢測用引物由中國吉瑪公司合成。

1.2 原代血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)

清潔級4～6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～22 g，斷頸處死后暴露胸腔及腹腔，完整分離主動脈，并置于預(yù)冷的組織清洗液（生理鹽水+1000 IU/mL青霉素+1000μg/mL 鏈霉素）中，于解剖學(xué)顯微鏡下清洗血污，剝離并去除外膜，保留血管中層。反復(fù)清洗2～3次后，將組織移入新的無菌培養(yǎng)皿中，將血管組織快速剪碎成約1 mm2大小的組織塊，均勻鋪于皿底，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置1 h。緩慢加入原代細(xì)胞培養(yǎng)液（F12培養(yǎng)基+20%胎牛血清+100 IU/mL 青霉素+100μg/mL鏈霉素），放置于培養(yǎng)箱中，每48 h更換新鮮原代細(xì)胞培養(yǎng)液。顯微鏡下定期觀察，當(dāng)達(dá)到理想的培養(yǎng)密度后進(jìn)行分盤培養(yǎng)。

1.3 ox LDL處理血管平滑肌細(xì)胞

使用不同濃度的ox LDL（0、12.5、25.0、50.0μg/mL）刺激原代平滑肌細(xì)胞48 h后，通過Western blot及real-time PCR 檢測平滑肌細(xì)胞表型MYH11及CD68的表達(dá)。使用50.0μg/mL的ox LDL刺激原代平滑肌細(xì)胞不同時間（0、15、30、60 min），使用不同濃度ox LDL（0、12.5、25.0、50.0μg/mL）刺激原代平滑肌細(xì)胞1 h后，通過Western blot檢測Src蛋白的激活情況。

1.4 Src特異性siRNA轉(zhuǎn)染

使用脂質(zhì)體試劑（Invitrogen公司）將Src特異性siRNA導(dǎo)入平滑肌細(xì)胞內(nèi)。設(shè)Src siRNA組，以100 nm/105個細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)染比例將Src特異性siRNA導(dǎo)入平滑肌細(xì)胞內(nèi)；設(shè)陰性siRNA 組，在平滑肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染無細(xì)胞效應(yīng)的siRNA。使用50μg/mL的ox LDL刺激原代平滑肌細(xì)胞48 h。

1.5 Src抑制劑處理血管平滑肌細(xì)胞

設(shè)Src抑制劑組，使用Src特異性活性抑制劑PP2（10μmol/L）預(yù)刺激原代血管平滑肌細(xì)胞1 h后，換正常培養(yǎng)基或50.0μg/mL ox LDL刺激48 h。設(shè)陰性刺激組，以PP3（10μmol/L）預(yù)刺激原代血管平滑肌細(xì)胞1 h后，換正常培養(yǎng)基或50.0μg/mL ox LDL刺激48 h。

1.6 Western blot檢測

取等量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h，成像儀曝光記錄蛋白條帶情況，并采用Image J軟件對其進(jìn)行灰度分析。

1.7 Real-time PCR檢測

使用SYBR Green PCR Master Mix反應(yīng)試劑盒和StepOne系統(tǒng)（Applied BioSystems）對MYH11及CD68的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。MYH11上游引物：5′-CGGCAACTCGTGTC CAAC-3′，下游引物：5′-GGTCTTCCATTTC GGCTTT-3′；CD68上游引物：5′-CCCAA GGAACAGAGGAAG-3′，下游引物：5′-GTGGCAGGGTTATGAGTG-3′；β-actin 上游引物：5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物：5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃10 s，65℃31 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用StepOne軟件v2.1（Applied BioSystems）對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ox LDL誘導(dǎo)原代平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化

MYH11為平滑肌細(xì)胞表型，CD68為巨噬細(xì)胞表型。ox LDL刺激平滑肌細(xì)胞后，隨著ox LDL刺激濃度的增加，MYH11的mRNA 表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，CD68的mRNA 表達(dá)水平呈濃度依賴性升高（P 均＜0.05）。ox LDL刺激平滑肌細(xì)胞后，隨著ox LDL刺激濃度的增加，MYH11的蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，而CD68的蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性升高（P 均＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度oxLDL對平滑肌細(xì)胞表型mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 ox LDL促進(jìn)原代平滑肌細(xì)胞中Src激活

為明確ox LDL對于血管平滑肌細(xì)胞中Src活化的影響，使用ox LDL刺激平滑肌細(xì)胞后檢測Src（Y-416）位點磷酸化水平及Src總蛋白表達(dá)水平，Src的活性以Src（Y-416）位點磷酸化水平（p-Src）與Src總蛋白表達(dá)水平（t-Src）的比值表示。ox LDL刺激平滑肌細(xì)胞后，隨著ox LDL刺激濃度的增加，Src活性（p-Src/t-Src）呈濃度依賴性與時間依賴性升高（P 均＜0.05）。見表2。

表2 oxLDL對平滑肌細(xì)胞中Src激活的影響

2.3 敲減Src表達(dá)可抑制ox LDL誘導(dǎo)的原代平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

為明確Src在ox LDL誘導(dǎo)平滑肌表型轉(zhuǎn)化中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染Src siRNA 敲低Src蛋白的表達(dá)水平，并觀察ox LDL刺激后平滑肌細(xì)胞的表型變化。在導(dǎo)入Src siRNA 及陰性siRNA 后，可見Src siRNA 顯著抑制Src在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.05）。而在ox LDL刺激后，陰性siRNA 組可見MYH11的蛋白表達(dá)水平顯著降低，CD68的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P 均＜0.05）；Src siRNA組MYH11和CD68的蛋白表達(dá)水平均未見明顯改變。見表3。

2.4 抑制Src蛋白活性可抑制ox LDL誘導(dǎo)的原代平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

為明確Src激活狀態(tài)在ox LDL誘導(dǎo)平滑肌表型轉(zhuǎn)化中的作用，我們通過Src特異性抑制劑PP2抑制Src蛋白的激活，并觀察ox LDL刺激后平滑肌細(xì)胞表型變化。結(jié)果顯示，Src抑制劑組平滑肌細(xì)胞中Src磷酸化水平明顯受抑（P＜0.05）。而在ox LDL刺激后，陰性刺激組MYH11的蛋白表達(dá)水平明顯降低，CD68 的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P 均＜0.05）。見表4。

表3 Src敲低后平滑肌細(xì)胞表型蛋白表達(dá)水平的影響

表4 Src活性抑制對平滑肌細(xì)胞表型蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ox LDL可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生平滑肌表型下調(diào)，而巨噬細(xì)胞表型上調(diào)。ox LDL可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中Src激活，抑制Src表達(dá)和活性均可減少ox LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型的變化，提示Src參與ox LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程。

Src激酶屬于PTK 家族成員，其他PTK 家族成員包括Yes、Fyn、Fgr、Lck、Hck、Blk、Lyn、Frk、Srm、Brk［4-5］。Src是PTK家族最早被發(fā)現(xiàn)的成員，結(jié)構(gòu)從氨基端到羧基端分別為豆蔻?；蛄?、單一序列、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域和羥基端調(diào)節(jié)尾端［6］。Src通過磷酸化修飾調(diào)控自身活性并向下傳遞信號。一般情況下，Src527位點酪氨酸處于磷酸化狀態(tài)，與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，此時Src呈卷曲狀態(tài)，將酶活性中心416位點酪氨酸磷酸化位點遮蔽。當(dāng)Src激酶與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合發(fā)生構(gòu)象改變時，416位點酪氨酸暴露并發(fā)生自身磷酸化，同時527位點去磷酸化，使激酶處于激活狀態(tài)，將細(xì)胞外信號向下傳遞。Src激酶作為受體結(jié)合型PTK，缺乏跨膜及胞外段，需與跨膜受體如激素受體、細(xì)胞因子及生長因子受體結(jié)合以傳遞細(xì)胞外信號，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞間黏附及脂質(zhì)累積［7］。

在動脈粥樣硬化中，Src 可結(jié)合并激活p47phox，繼而激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX），產(chǎn)生大量O2-，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與氧化應(yīng)激［8］。Src還參與絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）信號通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞炎性反應(yīng)和增殖遷移［9-10］，從而調(diào)控整個內(nèi)皮-平滑肌-巨噬細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)ox LDL可以通過提高Src（Y-416）酪氨酸磷酸化水平，促使Src活化，進(jìn)而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表型改變，使平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。在抑制Src表達(dá)及活化后，平滑肌細(xì)胞表型改變被抑制，提示Src的激活參與并調(diào)控平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

動脈粥樣斑塊中平滑肌細(xì)胞表型的表達(dá)降低和巨噬細(xì)胞表型的表達(dá)升高，與斑塊不穩(wěn)定明顯相關(guān)。在動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展過程中，平滑肌細(xì)胞遷出到內(nèi)皮下參與斑塊區(qū)纖維帽的形成，從而穩(wěn)定斑塊［11-12］。因此，平滑肌的表型轉(zhuǎn)化對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有重要意義。本研究通過體外分離并鑒定原代平滑肌細(xì)胞，均檢測到ox LDL可使原代平滑肌細(xì)胞中平滑肌表型MYH11表達(dá)降低，巨噬細(xì)胞表型CD68表達(dá)升高，表明ox LDL可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

探討動脈粥樣硬化過程中ox LDL誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，對研究動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)Src激活對平滑肌細(xì)胞表型的調(diào)控作用，有望為動脈粥樣硬化的治療提供潛在靶點。