基于“增效-減毒”的附子鹽制輔料的比較研究

張存艷 劉紅梅 魏藹玲 袁明昊 郭力 陳胡蘭 葉強(qiáng)

中圖分類號 R917;R283.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）10-1223-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.13

摘 要 目的：比較生附子及其5種鹽制炮制品中6種酯型生物堿成分的含量，為優(yōu)化附子鹽制工藝提供參考。方法：分別以膽巴、氯化鎂、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀為輔料炮制生附子，并采用高效液相色譜法測定生附子及上述5種鹽制炮制品中6種酯型生物堿的含量;采用效/毒比、毒性成分指數(shù)評價生附子及其5種鹽制炮制品的效果和毒性。結(jié)果：苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為2.440～24.40、2.240～22.40、2.020～20.20、2.780～27.80、2.240～22.40、2.240～22.40 μg/mL（r≥0.999 0）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%;加樣回收率分別為102.13%～104.87%（RSD=0.98%，n=6）、100.00%～105.00%（RSD=2.02%，n=6）、95.00%～99.29%（RSD=1.77%，n=6）、100.41%～104.58%（RSD=1.78%，n=6）、98.87%～99.90%（RSD=0.41%，n=6）、100.20%～104.00%（RSD=1.55%，n=6）?？偵飰A含量由高到低依次為生附子>氯化鈉炮制品>膽巴炮制品>氯化鉀炮制品>氯化鈣炮制品>氯化鎂炮制品。效/毒比由大到小依次為氯化鉀炮制品>氯化鎂炮制品>氯化鈉炮制品>氯化鈣炮制品>膽巴炮制品>生附子;毒性成分指數(shù)由大到小依次為生附子>氯化鈉炮制品>膽巴炮制品>氯化鈣炮制品>氯化鉀炮制品>氯化鎂炮制品。結(jié)論：以5種鹽為輔料的炮制方法均具有不同程度的 “增效-減毒”功效，其中以氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣炮制效果為佳，可用于附子的炮制。

關(guān)鍵詞 附子;鹽制輔料;增效-減毒;高效液相色譜法;酯型生物堿;含量測定

Comparative Study on the Salt-processed Excipients for Aconite Based on “Efficacy Enhancing and Toxicity Reducing”

ZHANG Cunyan，LIU Hongmei，WEI Ailing，YUAN Minghao，GUO Li，CHEN Hulan，YE Qiang（School of Pharmacy， Chengdu University of TCM/State Key Laboratory of TCM Resource System Research and Development Utilization， Southwest Genuine Medicinal Materials Collaborative Innovation Center， Chengdu 611137， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the contents of 6 kinds of ester alkaloids in raw aconite and 5 kinds of salt-processed products， and to provide reference for the optimization of salt-processing technology. METHODS： Processed with bittern， magnesium chloride， sodium chloride， calcium chloride and potassium chloride as excipients，and HPLC method were adopted to determine the contents of 6 kinds of ester alkaloids in raw aconite and 5 kinds of salt-processed products. The effect/toxicity ratio and toxicity component index were used to evaluate the effect and toxicity of raw aconite and 5 kinds of salt-processed products. RESULTS： The linear range of benzoylneoaconitine， benzoylhypoconitine， benzoylaconitine， neoaconitine， aconitine and hypoconitine were 2.440-24.40， 2.240-22.40， 2.020-20.20， 2.780-27.80， 2.240-22.40， 2.240-22.40 μg/mL （r≥0.999 0）. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 2%. The recovery rates were 102.13%-104.87% （RSD=0.98%， n=6）， 100.00%-105.00% （RSD=2.02%， n=6）， 95.00%-99.29% （RSD=1.77%， n=6）， 100.41%-104.58% （RSD=1.78%， n=6）， 98.87%-99.90% （RSD=0.41%， n=6）， 100.20%-104.00% （RSD=1.55， n=6）， respectively. The contents of total alkaloids in order from the largest to the smallest was as follows： raw aconite>processed products of sodium chloride>processed products of bittern>processed products of potassium chloride>processed products of calcium chloride>processed products of magnesium chloride. The order of effect/toxicity ratio was processed products of potassium chloride>processed products of magnesium chloride>processed products of sodium chloride>processed products of calcium chloride>processed products of bittern>raw aconite. The order of toxicity component index was raw aconite>processed products of sodium chloride>processed products of bittern>processed products of calcium chloride>processed products of potassium chloride>processed products of magnesium chloride. CONCLUSIONS： Using 5 kinds of salt as excipients， the processing technology has different degrees of “efficacy enhancing and toxicity reducing” effect. Among them， magne- sium chloride， potassium chloride and calcium chloride are better for processing and can be used for processing aconite.

KEYWORDS? Aconite; Salt-processed excipients; Efficacy enhancing and toxicity reducing; HPLC; Ester alkaloid; Content determination

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitμm carmichaelii Debx.）子根的加工品，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，酯型生物堿既是附子的有效成分，又是其毒性成分[2]，其中雙酯型生物堿（如烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等）是導(dǎo)致附子中毒的主要成分，同時也是其具有強(qiáng)心、抗炎和鎮(zhèn)痛等作用的主要活性物質(zhì);但這類物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，在濕熱條件下其8位上的乙?；装l(fā)生水解，得到相應(yīng)的單酯型生物堿，如苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿等，故炮制能將附子中具有毒性的雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為具有臨床療效且毒性較小的單酯型生物堿，因此臨床常以炮制品入藥[3]。附子炮制首見于《傷寒論》[4]，后又衍生出炒、煨、鹽制等多種炮制方法[5]，但大多已被淘汰，只有鹽制法沿用至今，并以膽巴為輔料進(jìn)行炮制，以達(dá)到減毒、增效和防腐的目的[6]。2015年版《中國藥典》（一部）中記載的附子炮制品鹽附子、黑順片、白附片均以膽巴浸泡[7]。但在此炮制過程中，膽巴可導(dǎo)致大量生物堿成分流失，使得有效成分的含量降低[8-9];此外，一些生產(chǎn)加工企業(yè)用膽巴浸泡后未將藥材徹底漂洗干凈，由于膽巴對皮膚、黏膜有較強(qiáng)的刺激作用，可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，若服用過量可引起中毒反應(yīng)[10]。2015年版《中國藥典》（一部）并未明確規(guī)定膽巴的浸泡時間和用量，故目前市場上用膽巴炮制的附子質(zhì)量參差不齊，臨床應(yīng)用時有中毒事件發(fā)生，嚴(yán)重影響了附子臨床療效[11]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，炮制輔料膽巴中含有大量的氯化鎂、氯化鈉、氯化鈣等無機(jī)鹽[10]。基于此，本研究按2015年版《中國藥典》（一部）“附子”項(xiàng)下“白附片”的炮制方法[1]，在前期優(yōu)化膽巴炮制工藝[10]的基礎(chǔ)上，分別采用氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉炮制附子，同時通過測定其中苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的含量變化來評價4種鹽制附子炮制品與膽巴炮制品、生附子的區(qū)別;采用效/毒比、毒性成分指數(shù)（TCI）評價生附子及其不同鹽制炮制品的效果和毒性，旨在為附子鹽制規(guī)范的建立及炮制工藝的完善提供參考，亦為中藥附子無膽炮制新工藝的確定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、紫外檢測器、LC1260色譜工作站（美國Agilent公司）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）;KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Rotavapor R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）;ΜPT-Ⅱ-107型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）;BP221S型十萬分之一電子分析天平（德國Satorious公司）;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

新鮮附子由四川江油中壩附子加工廠提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龍飛教授鑒定為毛莨科烏頭屬植物烏頭（A. carmichaelii Debx.）的子根。

烏頭堿對照品（批號：MΜST-18110905，純度：98.01%）、新烏頭堿對照品（批號：MΜST-18111308，純度：99.04%）、次烏頭堿對照品（批號：MΜST-19080210，純度：99.09%）、苯甲酰烏頭堿對照品（批號：MΜST-19032406，純度：98.99%）、苯甲酰新烏頭堿對照品（批號：MΜST-19032807，純度：99.73%）、苯甲酰次烏頭堿對照品（批號：MΜST-18110710，純度：99.66%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;膽巴（食品級，江油恒源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：20190217）;氯化鎂（批號：2019051801）、氯化鈣（批號：2019050201）、氯化鉀（批號：2019112301）、氯化鈉（批號：2019022101）均購自成都市科隆化學(xué)品有限公司;乙腈、四氫呋喃均為色譜純，異丙醇、二氯甲烷均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 附子炮制品的制備

2.1.1 生附子 將新鮮附子表面泥土洗凈，去須根，縱切成約0.3 cm的薄片，于37 ℃烘干，即得。

2.1.2 附子鹽制炮制品 將新鮮附子表面泥土洗凈，去掉須根后，放入含40%膽巴的水溶液（“花水”）中，以膽巴水溶液淹沒附子為宜，每日上下翻動1次，7 d后撈出，此時附子外皮色黃亮，質(zhì)松軟，為“膽附子”。將泡過附子的膽水（“老水”）煮沸，將膽附子倒入，以“老水”淹沒膽附子為宜，煮15～20 min，中途上下翻動1次，煮至透心，撈起，放入缸內(nèi)，以“老水”+清水（1 ∶ 1，V/V）浸泡1 d，得“冰附子”。取“冰附子”剝?nèi)ケ砥?，以“老水?清水（1 ∶ 1，V/V）浸泡過夜，中途攪動1～2次，將浸泡后的附子撈出，縱切成約0.3 cm的薄片，放入清水中浸泡48 h后換超純水再浸泡12 h，取出浸泡好的附子，放入蒸籠，蒸至蒸氣上頂后計時，以60 min為宜，將蒸好的附子于日光下曝曬（不可重疊），曬至近干，即成色澤白亮的白附片（即膽巴炮制品）。按上述工藝分別以氯化鈣、氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀（濃度均為40%）代替膽巴，制得氯化鈉炮制品、氯化鈣炮制品、氯化鉀炮制品、氯化鎂炮制品[12]。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Dianonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相（A）：乙腈-四氫呋喃（25 ∶ 15，V/V），流動相（B）：0.1 mol/L醋酸銨水溶液（每1 000 mL含冰醋酸0.5 mL），梯度洗脫（0～14 min，15%A→16%A;14～65 min，16%A→18%A;65～90 min，18%A→20%A;90～95 min，20%A）;檢測波長：235 nm;柱溫：30 ℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1 ∶ 1，V/V）混合溶液至刻度，混勻，即得上述6種成分質(zhì)量濃度分別為122、112、101、139、112、112 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下生附子及不同鹽制炮制品各適量，粉碎，過三號篩;取粉末各2.0 g，精密稱定，均按2015年版《中國藥典》（一部）“附子”項(xiàng)下方法[1]制備供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 以異丙醇-二氯甲烷（1 ∶ 1，V/V）混合溶液為陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分的理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，陰性對照對測定無干擾，詳見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，以異丙醇-二氯甲烷（1 ∶ 1，V/V）混合溶液稀釋，制得不同質(zhì)量濃度的系列線性工作溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，以異丙醇-二氯甲烷（1 ∶ 1，V/V）混合溶液稀釋，制得苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿質(zhì)量濃度分別為12.20、11.20、10.10、13.90、11.20、11.20 μg/mL的溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0.86%、1.64%、1.86%、1.17%、1.66%、1.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取生附子粉末，每份2.0 g，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品中6種成分的含量。結(jié)果，苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量的RSD分別為1.90%、0.60%、1.40%、1.00%、0.50%、0.68%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（生附子）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20 h時，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0.23%、0.46%、0.52%、0.32%、0.63%、0.26%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的生附子粉末，每份1.0 g，共6份，加入一定量的混合對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.2.11 樣品含量測定 精密稱取生附子及不同鹽制炮制品粉末各2.0 g，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表3[表中，“-”表示未檢出;總生物堿含量（mg/g）=（單酯型生物堿質(zhì)量+雙酯型生物堿質(zhì)量）/炮制品質(zhì)量×100%，單酯型生物堿百分含量（%）=單酯型生物堿含量×10-3×100%;雙酯型生物堿百分含量（%）=雙酯型生物堿含量×10-3×100%;單酯型生物堿成分包括苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿，雙酯型生物堿成分包括次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿]。

由表3可知，經(jīng)炮制后，不同鹽制炮制品中雙酯型生物堿成分含量均明顯低于生附子，表明鹽類輔料會促進(jìn)雙酯型生物堿成分水解轉(zhuǎn)化?？偵飰A含量由高到低依次為生附片>氯化鈉炮制品>膽巴炮制品>氯化鉀炮制品>氯化鈣炮制品>氯化鎂炮制品，表明以鹽類輔料炮制附子可使總生物堿含量降低。

2.3 效/毒比分析

有研究顯示，雙酯型生物堿成分是附子主要的毒性成分，而單酯型生物堿成分則具有較強(qiáng)的藥效活性，尤以苯甲酰烏頭堿較為顯著[3，13-14]。由于這些生物堿的毒效差異較大，故本研究采用效/毒比（效/毒比=單酯型生物堿含量/雙酯型生物堿含量，該值越大表示藥效越強(qiáng)、毒性越弱、品質(zhì)較優(yōu)[15]）比較生附片及其不同鹽制炮制品中各成分含量的差異，結(jié)果見表4。由表4可知，效/毒比由大到小依次為氯化鉀炮制品>氯化鎂炮制品>氯化鈉炮制品>氯化鈣炮制品>膽巴炮制品>生附子，表明以氯化鉀、氯化鎂、氯化鈉、氯化鈣為輔料炮制所得炮制品中活性成分含量較高、毒性成分含量較低。

2.4 TCI分析

TCI是一種采用面積歸一化法得到的毒性校正系數(shù)。本研究通過整合附子毒性成分的含量來計算TCI，以達(dá)到評價附子藥材及炮制品以量評毒效的目的[16-17]。TCI=0.338 7×新烏頭堿含量+0.183 5×次烏頭堿含量+0.477 8×烏頭堿含量，TCI越小表示樣品質(zhì)量越優(yōu)、毒性越小[15]。生附子及其不同鹽制炮制品TCI見表4。由表4可知，生附子及其不同鹽制炮制品的TCI為0.005 1～0.702 6，由大到小依次為生附子>氯化鈉炮制品>膽巴炮制品>氯化鈣炮制品>氯化鉀炮制品>氯化鎂炮制品，表明附子未炮制前毒性最大，經(jīng)不同鹽類輔料炮制后其毒性均有不同程度的降低，其中以氯化鎂為輔料炮制后的附子毒性最小。

3 討論

2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，附子炮制品含雙酯型生物堿以次烏頭堿（C33H45NO11）、新烏頭堿（C33H45NO10）和烏頭堿（C34H47NO11）的總量計，不得超過0.010%。本研究結(jié)果顯示，氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀炮制品中雙酯型生物堿含量占比分別為0.009 9%、0.002 8%、0.008 7%，均小于0.010%，符合藥典規(guī)定，表明以氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀為炮制輔料炮制附子均能達(dá)到減毒的目的;而氯化鈉、膽巴炮制品中雙酯型生物堿含量占比分別為0.017 4%、0.013 1%，高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明以氯化鈉、膽巴為輔料炮制附子雖然也有減毒的效果，但不能使其毒性成分含量降低至藥典規(guī)定范圍內(nèi)，還需聯(lián)合其他炮制方法以進(jìn)一步達(dá)到去毒的目的。

《本草圖經(jīng)》[18]中記載附子“善腐”，明代以前采用醋浸防腐，明代以后則采用鹽腌法，而現(xiàn)代已逐漸演變?yōu)槟懓团谥品╗19]。附子用膽巴浸泡可達(dá)到防腐的目的[6]，但由于后續(xù)炮制過程復(fù)雜且需用清水多次漂洗，這種操作不適用于附子的大批量產(chǎn)地加工。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同鹽溶液均可不同程度地降低附子中總生物堿及雙酯型生物堿成分的含量，驗(yàn)證了《藥籠小品》“土人以鹽腌之，其性愈減”[20]及《本草從新》“土人以鹽腌之，欲減其力”[21]的科學(xué)性。本研究結(jié)果還顯示，不同鹽制附子炮制品的效/毒比均高于膽巴炮制品及生附子，TCI除氯化鈉炮制品（亦低于生附子）外，均低于膽巴炮制品，表明附子經(jīng)鹽炮制后可實(shí)現(xiàn)減毒增效的目的。

綜上所述，以5種鹽為輔料的炮制方法均具有不同程度的“增效-減毒”功效，其中以氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣炮制效果為佳，可用于附子的炮制。

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（收稿日期：2020-02-19 修回日期：2020-04-09）

（編輯：陳 宏）