LC-HR-MS/MS法鑒定頭孢丙烯干混懸劑中的未知雜質(zhì)

肖穎 袁曉 林順權(quán)

中圖分類號(hào) R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）10-1217-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.12

摘 要 目的：檢測(cè)頭孢丙烯干混懸劑中的未知雜質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法檢測(cè)并鑒定頭孢丙烯干混懸劑中的未知雜質(zhì)。色譜柱為Thermo HyPURITYTM? C18，流動(dòng)相為乙腈-0.013%甲酸水溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長為230 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL;以電噴霧離子源行正離子全掃描，掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1 500，噴霧電壓為3.8 kV，金屬毛細(xì)管溫度為320 ℃，鞘氣壓力為60 Arb，輔助氣壓力為10 Arb，噴霧溫度為280 ℃。結(jié)果：在該色譜條件下，雜質(zhì)K的檢測(cè)限為0.202 μg/mL，精密度、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于4%。雜質(zhì)K附近發(fā)現(xiàn)3個(gè)未知雜質(zhì)，且互為異構(gòu)體，離子保留時(shí)間為17.83～19.31 min，二級(jí)母離子均為m/z 436.150 0[M+H]+，可能為頭孢丙烯開環(huán)、脫水后的產(chǎn)物。結(jié)論：本方法檢測(cè)出頭孢丙烯干混懸劑中雜質(zhì)K附近的3個(gè)未知雜質(zhì)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法;頭孢丙烯干混懸劑;雜質(zhì)K;未知雜質(zhì)

Identification of Unknown Impurities in Cefprozil Suspension by LC-HR-MS/MS

XIAO Ying1，YUAN Xiao2，LIN Shunquan2（1.Baiyunshan? Pharmaceutical? General? Factory， Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China;2.Guangzhou PI & PI Biotechnology Co.， Ltd.， Guangzhou 510530， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To determine unknown impurities in Cefprozil suspension， and to identify its structure. METHODS： LC-HR-MS/MS method was used to detect and identify unknown impurities in Cefprozil suspension. The determination was performed on Thermo HyPURITYTM? C18 with mobile phase consisted of acetonitrile-0.013% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm， and column temperature was 40 ℃. The sample size was 20 μL. ESI+ full scanning was carried out with electrospray ion source scanning range was mass-charge ratio （m/z） 100-1 500 with spray voltage of 3.8 kV， metal capillary temperature of 320 ℃， sheath gas pressure of 60 Arb， auxiliary gas pressure of 10 Arb， spray temperature of 280 ℃. RESULTS： Under this condition， the detection limit of impurity K was 0.202 μg/mL. RSDs of precision and reproducibility tests were both lower than 4%. Three unknown impurities were found around impurity K， which were isomers of each other. The retention time of ions were 17.83-19.31 min， and the secondary parent ion were all m/z 436.150 0[M+H]+， which may be the product of ring opening and dehydration of cefpropene. CONCLUSIONS： Three unknown impurities near impurity K in Cefprozil suspension were detected by this method.

KEYWORDS? ?LC-HR-MS/MS; Determination; Cefprozil suspension; Impurity K; Unknown impurities

頭孢丙烯是由美國Bristol-Myers Squibb公司于1983年開發(fā)的第2代頭孢菌素口服制劑[1-2]，于1992年以“Cefzil”的商品名在美國首次上市，其對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出良好的抑制活性，且安全性高、毒副作用小[3]。頭孢丙烯對(duì)細(xì)菌感染的療效與阿莫西林克拉維酸、紅霉素、頭孢克肟相似且優(yōu)于或等于同為第2代頭孢菌素的頭孢克洛和頭孢呋辛酯[4]。

頭孢丙烯是美國FDA批準(zhǔn)的第1個(gè)可用于治療兒童中耳炎和鼻竇炎的口服頭孢菌素類抗生素，目前該藥已知的特定雜質(zhì)包括雜質(zhì)A（α-對(duì)羥基苯甘氨酸）、雜質(zhì)B（頭孢羥氨芐）、雜質(zhì)D、 雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)M，其他非特定雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)N[5]。有研究報(bào)道，頭孢丙烯結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，所以其在水或酸性溶液等情況下易發(fā)生水解開環(huán)而失去抗菌活性[6]。

頭孢丙烯干混懸劑為兒童用藥劑型，加入的輔料相較片劑更多，制劑受輔料影響也較大，因而制劑中仍有一些未知的雜質(zhì)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在某廠生產(chǎn)的頭孢丙烯干混懸劑中，在雜質(zhì)K色譜峰附近還有其他未知的雜質(zhì)，且這些雜質(zhì)在貯存過程中還會(huì)逐漸增加。

目前，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）[7]在各類藥物的雜質(zhì)分析中已被廣泛應(yīng)用[8-12]，尤其是抗生素類如β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等藥物的雜質(zhì)分析[13]。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（LC-HR-MS/MS）定性研究了頭孢丙烯干混懸劑中雜質(zhì)K附近的未知雜質(zhì)，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，旨在為頭孢丙烯干混懸劑生產(chǎn)中的雜質(zhì)控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Q-Exactive Focus型高分辨質(zhì)譜儀、Dionex UltiMate 3000 RS型超高效液相色譜（UPLC）儀（包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;1260型HPLC儀（美國Agbilent公司）;AR2140型分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

頭孢丙烯干混懸劑（批號(hào)：02180802，規(guī)格：0.125 g）及其空白輔料均由廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠提供;頭孢丙烯雜質(zhì)K標(biāo)準(zhǔn)品[廣州牌牌生物科技有限公司，批號(hào)：PITBBX-K-EP-20181017-01，純度：96.64%（以4個(gè)異構(gòu)體的總和計(jì)）];乙腈、甲酸均為質(zhì)譜純，磷酸二氫銨為分析純，其余試劑均為分析純，水為自制純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雜質(zhì)K對(duì)照品溶液 精密稱取頭孢丙烯雜質(zhì)K標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水配制成質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取頭孢丙烯干混懸劑100 mg，溶于水5 mL中，超聲（功率：360 W，頻率：40 kHz，下同）使溶解，濾過，取濾液，即得。

2.1.3 空白輔料溶液 精密稱取頭孢丙烯干混懸劑空白輔料1.97 g，溶于水5 mL中，超聲使溶解，濾過，即得。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo HyPURITYTM C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.013%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）;檢測(cè)波長：230 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描;掃描模式：全掃描;掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）100～1 500;噴霧電壓：3.8 kV;金屬毛細(xì)管溫度：320 ℃;鞘氣壓力：60 Arb;輔助氣壓力：10 Arb;噴霧溫度：280 ℃;相對(duì)碰撞能（NCE）：10、20、30。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.1”項(xiàng)下雜質(zhì)K對(duì)照品溶液、空白輔料溶液和供試品溶液各20 μL，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。另對(duì)頭孢丙烯干混懸劑進(jìn)行高溫（以水溶解，60 ℃水浴2 h）、酸（以0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，60 ℃水浴6 h）、堿（以0.08 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，室溫靜置1 h）、氧化（以1%過氧化氫溶液溶解，室溫靜置1 h）、光照（以水溶解，4 500 lx光照18 h）破壞后，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白輔料對(duì)頭孢丙烯2個(gè)主峰（異構(gòu)體Z、E）測(cè)定均無干擾;頭孢丙烯干混懸劑經(jīng)高溫、酸、堿、氧化、光照破壞后也均無明顯降解。色譜圖見圖1（圖中，1～6號(hào)峰依次為頭孢丙烯異構(gòu)體Z、頭孢丙烯異構(gòu)體E、雜質(zhì)K1、雜質(zhì)K2、雜質(zhì)K3、雜質(zhì)K4，下同）。

2.3.2 檢測(cè)限考察 精密稱取頭孢丙烯雜質(zhì)K標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相A配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的貯備液;將上述貯備液用流動(dòng)相A逐級(jí)稀釋，按“2.2”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算能被檢測(cè)出的雜質(zhì)K的最低質(zhì)量濃度，即為檢測(cè)限。結(jié)果，當(dāng)信噪比為3.1 ∶ 1時(shí)得雜質(zhì)K的檢測(cè)限為0.202 μg/mL。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，使用不同的儀器于2日內(nèi)，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，12次測(cè)得的峰面積的RSD為3.90%，表明本方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)K的含量。結(jié)果，含量的RSD為3.70%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將雜質(zhì)K對(duì)照品溶液分別在室溫放置0、1、2、4、6、8 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，各時(shí)間點(diǎn)峰面積的RSD為0.98%～1.02%（n=6）。

2.4 未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 LC-HR-MS檢測(cè) 分別取雜質(zhì)K對(duì)照品溶液、供試品溶液，以及供試品溶液與雜質(zhì)K對(duì)照品溶液的混合溶液（混合體積比約為20 ∶ 1），按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行LC-HR- MS測(cè)定，結(jié)果見表2～表4，LC-HR-MS圖見圖2～圖4（圖中，7～9號(hào)峰依次為雜質(zhì)Z1、雜質(zhì)Z2、雜質(zhì)Z3，下同）。

通過對(duì)比LC-HR-MS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頭孢丙烯雜質(zhì)K對(duì)照品（4個(gè)異構(gòu)體，分別命名為K1、K2、K3、K4）與供試品中4個(gè)未知雜質(zhì)保留時(shí)間和準(zhǔn)分子離子基本一致。另外，供試品中還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)未知雜質(zhì)，保留時(shí)間分別為17.75、18.60、19.23 min，其準(zhǔn)分子離子基本相同，推測(cè)其互為異構(gòu)體，統(tǒng)稱為雜質(zhì)Z（分別命名為Z1、Z2、Z3）;再根據(jù)準(zhǔn)分子離子，推測(cè)雜質(zhì)Z可能為頭孢丙烯開環(huán)乙酯。

2.4.2 LC-HR-MS/MS二級(jí)裂解檢測(cè) 為進(jìn)一步確認(rèn)雜質(zhì)K和雜質(zhì)Z的結(jié)構(gòu)，按“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行LC-HR-MS/MS二級(jí)裂解，雜質(zhì)Z1、Z2、Z3的LC-HR-MS/MS圖見圖5，雜質(zhì)K和雜質(zhì)Z1、Z2、Z3的LC-HR-MS/MS檢測(cè)結(jié)果見表5，分析結(jié)果見表6。

“2.2”項(xiàng)條件下，雜質(zhì)K的二級(jí)母離子m/z約為 390[M+H]+，故其相對(duì)分子量為389，與頭孢丙烯相同，提示兩者可能互為異構(gòu)體，推測(cè)雜質(zhì)K為頭孢丙烯四元環(huán)水解再與7位側(cè)鏈氨基脫水合環(huán)，3位側(cè)鏈雙鍵發(fā)生水合與2位羧基脫水酯化后所得的化合物，其實(shí)測(cè)準(zhǔn)分子離子與理論準(zhǔn)分子離子誤差小于5 ppm，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，確定雜質(zhì)K結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)K二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑見圖6，結(jié)構(gòu)見圖7。

在“2.2”項(xiàng)條件下，雜質(zhì)Z的二級(jí)母離子m/z約為436[M+H]+，故其相對(duì)分子量為435，與頭孢丙烯分子量差46，多1個(gè)乙醇分子量，推測(cè)雜質(zhì)Z為頭孢丙烯四元環(huán)水解開環(huán)與乙醇發(fā)生酯化所得的化合物，其實(shí)測(cè)準(zhǔn)分子離子與理論準(zhǔn)分子離子誤差小于5 ppm，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，確定雜質(zhì)Z結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)Z二級(jí)質(zhì)譜裂解路徑見圖8，結(jié)構(gòu)見圖9。

3 討論

本研究以頭孢丙烯雜質(zhì)K為對(duì)象，采用LC-HR- MS/MS法對(duì)頭孢丙烯干混懸劑中的雜質(zhì)K及其附近的未知雜質(zhì)進(jìn)行了定性研究，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，這些雜質(zhì)為雜質(zhì)Z，包含Z1、Z2、Z3，互為異構(gòu)體。本文前期研究結(jié)果顯示，雜質(zhì)K（含K1、K2、K3、K4，互為異構(gòu)體）為頭孢丙烯干混懸劑在長期貯存條件下降解產(chǎn)生，雜質(zhì)Z（含Z1、Z2、Z3）推測(cè)為頭孢丙烯干混懸劑中頭孢丙烯受輔料的影響，在放置過程中頭孢丙烯開環(huán)并脫水所得。干混懸劑及混懸劑由于加入的輔料種類比較多，因此這一類劑型設(shè)計(jì)處方時(shí)，應(yīng)充分考慮輔料與原料的相容性，了解并考察在產(chǎn)品的放置過程中其雜質(zhì)的降解與產(chǎn)生過程，合理設(shè)計(jì)處方。

綜上所述，本文定性研究了頭孢丙烯干混懸劑中的雜質(zhì)K、雜質(zhì)Z，可為頭孢丙烯干混懸劑生產(chǎn)中的雜質(zhì)控制提供參考。

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（收稿日期：2019-12-10 修回日期：2020-03-20）

（編輯：鄒麗娟）