CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合AAV對(duì)Rosa-mTmG小鼠的MEF細(xì)胞進(jìn)行編輯

丁 楠，韓興龍，武宏春，楊靜思，王 勇，趙振奧，雷 偉，殷為民，胡士軍

(1. 蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 心血管病研究所，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心臟大血管外科，江蘇 蘇州 215006)

目前，基因療法被認(rèn)為是某些人類疾病最好的治療選擇.盡管在早期臨床研究中遇到了許多困難與挫折，但也推動(dòng)了基礎(chǔ)研究，使研究者們找到了更安全、更有效的基因治療載體.各種類型的基因治療已經(jīng)為失明、神經(jīng)肌肉疾病、血友病以及免疫缺陷病帶來(lái)了顯著的治療效果[1].其中，利用基因編輯技術(shù)對(duì)致病基因進(jìn)行修飾以及更正是最有效的基因療法之一.基因編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛地用于生物學(xué)研究中，研究者們?cè)缙诓捎玫牡谝淮\指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)以及第二代轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALEN)基因編輯技術(shù)具有耗時(shí)長(zhǎng)，成本高以及操作繁瑣等缺點(diǎn)，而第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat/associated 9)克服了ZFN和TALEN技術(shù)上的一些不足[2-3]，具有低成本、易操作、高效性等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前應(yīng)用最廣泛，最受研究者們青睞的基因編輯技術(shù)[4].

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由一條起引導(dǎo)作用的單鏈RNA(single guide RNA, sgRNA)和一個(gè)具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白組成.Cas9-sgRNA形成復(fù)合體，切斷目標(biāo)DNA序列，細(xì)胞主要通過(guò)兩種方式修復(fù)DNA，即同源重組和非同源末端連接，在修復(fù)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA序列的改變[5-6].但是在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，傳統(tǒng)所使用的來(lái)源于化膿鏈球菌屬(Streptococcuspyogenes)的SpCas9蛋白編碼基因太大(SpCas9，≈4.2kb)，限制了其在AAV中的應(yīng)用，因?yàn)锳AV所能承載的插入片段大小約為4.5kb左右，SpCas9編碼序列加上表達(dá)調(diào)控元件和sgRNA無(wú)法被包裝到AAV中.為了克服SpCas9太大的問(wèn)題，研究者們又發(fā)現(xiàn)了一種可以替代SpCas9蛋白的來(lái)源于葡萄球菌屬(Staphylococcusaureus)的SaCas9蛋白，其基因比SpCas9蛋白基因少1000多個(gè)堿基，卻具有與SpCas9相似的編輯效率[7].

AAV病毒是一種無(wú)包膜的單鏈DNA病毒，其具有多種血清型以及組織嗜親性[8].AAV病毒血清型主要有AAV5、AAV6和AAV9等，例如AAV5對(duì)肝臟具有較強(qiáng)的組織嗜親性[9].并且有研究證明無(wú)論在體內(nèi)注射AAV還是在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行AAV的感染，轉(zhuǎn)基因都有較高的表達(dá)豐度[10].雖然AAV相比于慢病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒而言具有不能包裝超過(guò)5kb大小的DNA的缺點(diǎn)，但是其具有極低的免疫原性，暫未發(fā)現(xiàn)致病性，具有較高的安全性，且AAV載體能夠高效地靶向動(dòng)物體內(nèi)的各種組織，包括肝臟、視網(wǎng)膜、心肌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，具有較強(qiáng)的組織特異性[11].所以，AAV因其卓越的安全性能以及極高的組織特異性，使其成為應(yīng)用于臨床治療的首選基因治療載體[12-13].最近一項(xiàng)研究表明： 利用AAV9包裝啟動(dòng)子為肌鈣蛋白T(cTNT)的表達(dá)eGFP的質(zhì)粒，通過(guò)靜脈注射病毒，在體內(nèi)只在心臟中能夠觀察到eGFP表達(dá)，而在肝臟中卻觀察不到eGFP，且與對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯的免疫反應(yīng).在體外，對(duì)新生鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行AAV的感染，絕大多數(shù)的細(xì)胞可以觀察到eGFP表達(dá)，該研究再次證明了AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的高效性、安全性、特異性等優(yōu)點(diǎn)[10].

濫用政府信息公開申請(qǐng)權(quán)行為的法律規(guī)制——兼論國(guó)外實(shí)踐對(duì)中國(guó)的啟示 ………………………………………………… 王學(xué)棟，趙小靜（1．41）

在本研究中，我們采用了Rosa-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠模型模擬基因缺陷疾病，并提取其胎鼠的MEF細(xì)胞進(jìn)行體外研究.利用CRISPR/Cas9技術(shù)并聯(lián)合AAV載體，在體外對(duì)其自發(fā)tdTomato紅色熒光的MEF細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，敲除其tdTomato熒光蛋白以及eGFP熒光蛋白前的終止子，使其eGFP表達(dá)能夠被觀察到，為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)，為對(duì)某些基因缺陷型疾病進(jìn)行基因修飾和更正提供了一種簡(jiǎn)單方便且效果可視化的研究工具.

1 材料與方法

1.1 材料

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

1.2 方法

基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，參照本課題組前期研究結(jié)果[8]，在基礎(chǔ)飼料中用2%的共軛亞油酸（青島奧海生物有限公司，43.8%c9t11-CLA和47.3%t10c12-CLA）替代等量豆油配制試驗(yàn)飼料（CLA組）。手工將飼料原料混合均勻，制成直徑2.0 mm的顆粒飼料，45℃的恒溫干燥，使飼料水分含量小于10%，然后-20℃保存待使用。

表1 引物列表

CMV-PX601-sgRNA構(gòu)建： 首先，使用BsaⅠ限制性內(nèi)切酶將載體PX601-AAV-CMV進(jìn)行酶切，使其線性化，進(jìn)行膠回收.然后設(shè)計(jì)攜帶BsaⅠ限制性酶切位點(diǎn)的靶向序列g(shù)uide RNA(gRNA)，上游為gRNA-sense，下游為gRNA-antisense，gRNA序列見(jiàn)表1.

gRNA-sense和gRNA-antisense變性并退火(50μL體系中含有10μmol/L的上下游序列各10μL、10×退火緩沖液加5μL、雙蒸水25μL，混勻后于95℃加熱5min，然后自然冷卻至室溫).用T4 DNA連接酶將其與線性化的PX601-AAV-CMV進(jìn)行連接，體系為10μL(1μL T4連接酶緩沖液、1μL T4 DNA連接酶、100ng線性化載體PX601-AAV-CMV和50ng sgRNA變性退火產(chǎn)物)，于4℃連接過(guò)夜.用E.coliStbl3感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)增后，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為U6-Promoter(序列見(jiàn)表1).

同伴互評(píng)是指“學(xué)生對(duì)同伴的寫作進(jìn)行閱讀、批評(píng)和提供反饋的協(xié)同活動(dòng)； 通過(guò)互相的支架策略，既確保了文本的即時(shí)改進(jìn)，又逐步地增強(qiáng)了寫作能力”[4]321-322。 可見(jiàn)，同伴反饋僅僅是同伴互評(píng)的一部分，同伴互評(píng)還包括閱讀和批評(píng)寫作文本。

MEF細(xì)胞提?。?頸椎脫臼法處死孕13.5d Rosa-mTmG鼠，剪開下腹皮膚，打開腹腔，取出子宮，分離子宮膜，將子宮移入盛有DPBS的培養(yǎng)皿中，去除胎膜，取出胎鼠.用眼科剪去除軀干以外部分，DPBS清洗至無(wú)肉眼可見(jiàn)血色.剪碎后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，并加入適量胰酶于37℃消化20min，之后加入血清終止消化.用70μm濾網(wǎng)過(guò)濾MEF細(xì)胞，200g離心3min，完全培養(yǎng)基(含10%FBS以及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞沉淀后，接種在明膠包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2培養(yǎng)，兩天更換一次培養(yǎng)液.

1.2.2 小鼠基因型的鑒定

to crash in Russia,killing all 71 people on board,investigatorssay.

所以，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全預(yù)警能夠被定位成：結(jié)合預(yù)警方式和理論，全面分析和評(píng)估反映農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的指標(biāo)，并評(píng)判農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)程度和安全現(xiàn)狀以及日后的發(fā)展，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全趨勢(shì)的發(fā)展變化進(jìn)行科學(xué)、合理的預(yù)測(cè)，從而及時(shí)拉響警報(bào)的過(guò)程[2]。

1.2.3 原代細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

cTNT-PX601-sgRNA的構(gòu)建： 首先從pENN.AAV.cTNT.PI.eGFP.WPRE.rBG質(zhì)粒上擴(kuò)增出cTNT啟動(dòng)子，引物為分別在上下游引物上添加了XbaⅠ和AgeⅠ的酶切位點(diǎn)(序列見(jiàn)表1).然后用XbaⅠ和AgeⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物以及CMV-PX601-sgRNA質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，純化之后依次進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，與構(gòu)建CMV-PX601-sgRNA質(zhì)粒后續(xù)操作相似.相關(guān)載體構(gòu)建的示意圖見(jiàn)圖1.

CF(Cardiac Fibroblast)細(xì)胞的提?。?取8只出生72h內(nèi)乳鼠心臟，剪成1～3mm3大小的組織塊，加入適量0.25%胰酶消化，取上清用血清終止消化，重復(fù)上述步驟，直至心臟組織消化成白色絮狀物即可，用70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾消化所得的細(xì)胞，300g轉(zhuǎn)速離心3min，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后，接種在明膠包被的6cm培養(yǎng)皿中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)1.5h后，吸去培養(yǎng)液，并輕輕吹打皿底7～8下，以去除非CF細(xì)胞.重新加入4mL完全培養(yǎng)基，兩天換一次培養(yǎng)液即可.

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

細(xì)胞的轉(zhuǎn)染： 細(xì)胞接種于六孔板，密度達(dá)到70%時(shí)，采用Thermo Fisher公司的Lipofectamine?3000 Transfecting Kit進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，即用125μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液加5μg重組質(zhì)粒CMV-PX601-sgRNA和5μL p3000TM充分混勻后與125μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋的LipofecteminTM3000混合并室溫孵育15min，將該混合液體加到細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)72h后提取RNA以及蛋白質(zhì).

第二，電永磁吸附式上部裝配平臺(tái)：電永磁吸附式上部平臺(tái)（見(jiàn)圖1右側(cè)部分）主要用于搭接及對(duì)接激光焊接試驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)厚度為3mm+2mm或以上組合不銹鋼搭接試板的壓緊。電永磁吸盤通過(guò)螺栓連接固定在下部支撐框架平臺(tái)上，連接可靠拆卸方便。導(dǎo)磁塊安裝于電永磁吸盤上，安裝好后進(jìn)行整體加工，加工后導(dǎo)磁塊厚度為20mm，最后進(jìn)行表面鍍鉻處理。鍍鉻處理后，鍍層附著良好，不會(huì)出現(xiàn)脫落剝離現(xiàn)象。

采用TRIzol方法進(jìn)行細(xì)胞RNA的提取，RNA經(jīng)DNaseⅠ消化質(zhì)粒DNA等步驟進(jìn)一步純化，最后利用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度.500ng總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后，使用SYBR Green染料的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR.在AB StepOnePlus儀器上進(jìn)行PCR反應(yīng)程序、數(shù)據(jù)收集與分析.PCR反應(yīng)總體系為20μL： SYBR Green mix(2×)加入10μL，正向引物(10μmol/L)加入0.8μL，反向引物(10μmol/L)加入0.8μL，ROX Reference Dye(50×)加入0.4μL和cDNA樣本2μL，去離子水6μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，40個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)(95℃變性5s，60℃退火30s).使用18S作為內(nèi)參，引物序列如表1所示.

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

1.2.1 重組質(zhì)粒CMV-PX601-sgRNA和cTNT-PX601-sgRNA的構(gòu)建

向收集的MEF細(xì)胞沉淀中加入200μL RIPA(含1%體積的蛋白酶抑制劑)，冰上裂解10min，之后以12000g轉(zhuǎn)速于4℃離心10min，取上清.用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，B液∶A液按照50∶1比例混勻，每孔加入200μL的混合液以及10μL的蛋白樣品，37℃孵育30min，用酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定.蛋白質(zhì)免疫印跡的具體步驟： 制備10%的SDS-PAGE膠，蛋白上樣量為15μg，100V電泳2h后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上(200mA電泳90min)；5%脫脂牛奶封閉1h后孵育一抗(一抗用一抗稀釋液1∶1000稀釋，4℃，孵育過(guò)夜)；孵育二抗(二抗1∶5000稀釋，室溫孵育2h)，最后用ChemiDocXRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影.

取鼠尾1～2mm，加入75μL堿性溶液，金屬浴加熱15min，中間震蕩幾下，然后置于冰上冷卻5min，加入75μL中和溶液，充分混勻，隨后取2～5μL用于后續(xù)的PCR鑒定.PCR的反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)(95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)；72℃后延伸5min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).堿性溶液含有25mmol/L NaOH和0.2mmol/L EDTA，pH≈12.中和溶液為pH≈5的40mmol/L Tris-HCl.

1.2.6 AAV包裝

目前，胰腺癌診斷十分困難，且進(jìn)展快、預(yù)后差，中位生存期僅4～6個(gè)月，到2030年其發(fā)病率預(yù)計(jì)將增長(zhǎng)1倍左右[5-7]。胰腺癌發(fā)病機(jī)制尚不清楚，炎癥、肥胖、乙醇、吸煙、氧化應(yīng)激等因素可導(dǎo)致免疫代謝紊亂和微環(huán)境改變，激活腫瘤信號(hào)通路，參與胰腺癌發(fā)病，目前尚無(wú)有效的診治手段。因此，探尋新的解決方法迫在眉睫。

293NT細(xì)胞培養(yǎng)在15cm培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)基為含有10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基)，細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行病毒包裝.病毒包裝步驟如下： 將CMV-PX601-sgRNA 12μg、δF6 10μg、AAV2/9 6μg和PEI(1μg/μL) 100μL加到500μL的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，室溫靜置5min，然后加至一個(gè)15cm培養(yǎng)皿的293NT細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48h至72h收病毒，并使用AAVpro Purification試劑盒對(duì)病毒進(jìn)行提取和濃縮.

由表2中的不均勻系數(shù)變化可以看出，在整個(gè)充填過(guò)程中，對(duì)應(yīng)的材料充填不均勻系數(shù)變化會(huì)影響整體的充填技術(shù)應(yīng)用效果，應(yīng)該在充填技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中，及時(shí)將對(duì)應(yīng)的充填技術(shù)控制中的不均勻系數(shù)控制好，這樣才能滿足整體的鉛鋅礦充填工藝運(yùn)行效果。

PX601-AAV-CMV和pENN.AAV.cTNT.PI.eGFP.WPRE.rBG質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司；大腸桿菌E.coliStbl3感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN試劑盒以及AAV純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Rosa-mTmG鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)；引物合成自蘇州金唯智生物科技有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自碧云天公司；Lipofectamine?3000 Transfecting Kit購(gòu)自Thermo Fisher公司；HA抗體購(gòu)自Roche公司.

采用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)eGFP的細(xì)胞陽(yáng)性率，MEF細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3min，用血清終止消化，300g離心3min，用300μL DPBS重懸，通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)eGFP的細(xì)胞陽(yáng)性率.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組結(jié)果之間的比較采用t檢驗(yàn)，設(shè)定P<0.05則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.(注：*P<0.05被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義).

2 結(jié) 果

2.1 mTmG小鼠的基因型鑒定

本研究采用Rosa-mTmG小鼠模型模擬基因缺陷疾病.如圖2(a)所示為Rosa-mTmG小鼠的基因模式圖，Rosa-mTmG小鼠提取的MEF細(xì)胞形態(tài)如圖2(b)左圖所示，呈長(zhǎng)梭形，在熒光顯微鏡下可以清晰地觀察到MEF細(xì)胞都呈現(xiàn)出紅色熒光，這與圖1(a)的原理是相吻合的.為了進(jìn)一步準(zhǔn)確的鑒定Rosa-mTmG小鼠的基因型，我們用PCR擴(kuò)增的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型進(jìn)行了鑒定，引物序列信息見(jiàn)表1.如圖2(c)所示，呈現(xiàn)一條330bp電泳條帶的為野生型小鼠；呈現(xiàn)一條330bp和一條250bp電泳條帶的為雜合型小鼠，呈現(xiàn)一條250bp電泳條帶的為純和型轉(zhuǎn)基因小鼠.

2.2 重組質(zhì)粒CMV-PX601-sgRNA對(duì)MEF細(xì)胞的編輯作用

首先，由于PX601-AAV-CMV質(zhì)粒中含有BsaⅠ限制性酶切位點(diǎn)，而在CMV-PX601-sgRNA重組質(zhì)粒中該酶切位點(diǎn)丟失，所以我們采用BsaⅠ限制性酶對(duì)構(gòu)建前后的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，如圖3(a)的電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)3條帶的為CMV-PX601-sgRNA質(zhì)粒，這3條帶分別是超螺旋結(jié)構(gòu)、線性和環(huán)形，而PX601-AAV-CMV質(zhì)粒只有1條被酶切開的條帶.直接測(cè)序的結(jié)果也顯示了CMV-PX601-sgRNA構(gòu)建成功(圖3(b)).

接下來(lái)，我們將通過(guò)CMV-PX601-sgRNA瞬轉(zhuǎn)MEF細(xì)胞檢測(cè)其基因編輯效率.用特異于SaCas9基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證明了CMV-PX601-sgRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)MEF中(圖3(c))，并且采用qPCR檢測(cè)到SaCas9mRNA水平的顯著高表達(dá)(圖3(d)).在我們的重組質(zhì)粒中，SaCas9蛋白上帶有HA標(biāo)簽蛋白，可以通過(guò)檢測(cè)HA標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，從而反應(yīng)SaCas9蛋白的表達(dá)，蛋白大小約130kD.蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SaCas9蛋白成功表達(dá)(圖3(e)).通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果分析得到MEF的編輯效率圖(圖3(f)和(g))，同時(shí)在熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組MEF只呈紅色熒光，而采用CMV-PX601-sgRNA進(jìn)行基因編輯的細(xì)胞呈綠色熒光.但由于瞬轉(zhuǎn)效率有限，只有一部分MEF發(fā)綠色熒光(圖3(h)).以上結(jié)果表明，我們利用CMV-PX601-sgRNA的CRISPR/Cas9技術(shù)是可以成功發(fā)揮基因編輯作用的.

從問(wèn)卷的調(diào)查數(shù)據(jù)來(lái)看，廬山西海的游客主要集中于廬山西海及周邊地區(qū)，省內(nèi)外的游客較少，這也是影響廬山西?？驮吹囊粋€(gè)重要原因。

2.3 AAV介導(dǎo)的CMV-PX601-sgRNA對(duì)MEF細(xì)胞的編輯作用

如前所述，我們證明了利用CMV-PX601-sgRNA的CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)MEF細(xì)胞進(jìn)行基因編輯的有效性.為進(jìn)一步提高其編輯效率，我們采用AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)MEF細(xì)胞進(jìn)行基因編輯.首先，我們檢測(cè)了AAV滴度(圖4(a))，然后感染MEF細(xì)胞.經(jīng)qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到SaCas9在MEF中成功高表達(dá)(圖4(b)和(c)).熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞不再呈現(xiàn)紅色熒光，轉(zhuǎn)而呈現(xiàn)出綠色熒光(圖4(d)).流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有較高的編輯效率(圖4(e)和(f)).

2.4 重組質(zhì)粒cTNT-PX601-sgRNA的構(gòu)建及特異性的證明

為了靶向特定的組織器官進(jìn)行基因編輯，我們還可以利用特異的啟動(dòng)子以及腺相關(guān)病毒的組織嗜親性以實(shí)現(xiàn)對(duì)某些特定組織器官中基因缺陷類疾病的基因治療.以特異性編輯心肌細(xì)胞為例，我們構(gòu)建了cTNT啟動(dòng)子表達(dá)SaCas9的質(zhì)粒cTNT-PX601-sgRNA(圖5(a)).并分別對(duì)心肌細(xì)胞系HL-1細(xì)胞，MEF和CF進(jìn)行測(cè)試.用qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)了SaCas9的mRNA和蛋白的表達(dá)，圖5(b)，(c)結(jié)果顯示SaCas9只在心肌細(xì)胞中高表達(dá).證明了cTNT啟動(dòng)子的心肌特異性.以上結(jié)果提示我們，cTNT-PX601-sgRNA可用于后續(xù)特異性編輯心肌細(xì)胞的研究中.

3 討 論

本研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合AAV能夠在體外高效地對(duì)Rosa-mTmG轉(zhuǎn)基因鼠的MEF細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，使其在熒光顯微鏡下由呈現(xiàn)tdTomato紅色熒光轉(zhuǎn)變成呈現(xiàn)eGFP綠色熒光.

AAV是一種廣泛用于基因治療的載體系統(tǒng)[14]，其是無(wú)包膜的單鏈DNA病毒，具有兩個(gè)末端重復(fù)序列[15].已有的研究表明，AAV是安全和有效的病毒載體，其在注射完后，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定有效，且沒(méi)有已知的致病性[16].CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已經(jīng)被證實(shí)是一種強(qiáng)大的基因編輯工具，它適用于基因敲除，對(duì)基因進(jìn)行特定的修飾以及用靶向特定基因的方式對(duì)轉(zhuǎn)錄激活以及抑制進(jìn)行調(diào)控[17].而本研究則是將AAV與CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合起來(lái)，在體外對(duì)Rosa-mTmG轉(zhuǎn)基因鼠的MEF實(shí)現(xiàn)了高效的基因編輯.有研究表明AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9遞送，無(wú)論在體外還是體內(nèi)都具有較高的編輯效率[10].雖然本研究并未涉及到體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，但體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示我們，可利用AAV的組織嗜親性對(duì)Rosa-mTmG轉(zhuǎn)基因鼠的特定組織細(xì)胞進(jìn)行基因編輯.

有研究表明，利用AAV的組織嗜親性以及特異性的啟動(dòng)子可以靶向編輯特定的器官而對(duì)其他組織器官幾乎不造成影響，例如cTNT啟動(dòng)子是心肌特異性的啟動(dòng)子，AAV9對(duì)心臟具有較高的組織的嗜親性[10,18-19]以及肝臟特異性的啟動(dòng)子hAAT，腺相關(guān)病毒8(AAV8)對(duì)肝臟具有較高的組織嗜親性[16].有文獻(xiàn)報(bào)道，一些研究者們運(yùn)用小鼠的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥模型，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)聯(lián)合AAV9對(duì)小鼠進(jìn)行杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的修復(fù)，在一定程度上改善了肌營(yíng)養(yǎng)不良的癥狀，增強(qiáng)了骨骼肌的功能[20-21].這些都為AAV聯(lián)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)更好地應(yīng)用于臨床研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).同時(shí)，也給其他的研究者們提供了一些新的思路，我們可以利用小鼠構(gòu)建人類的基因缺陷疾病的模型，然后利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)以及AAV的優(yōu)點(diǎn)對(duì)模型鼠的缺陷基因進(jìn)行基因敲除，插入以及修正等.如果某些基因缺陷類的疾病是針對(duì)特定組織器官的，我們還可以利用特異的啟動(dòng)子以及腺相關(guān)病毒的組織嗜親性，靶向特定的器官，而不影響其他器官的功能，通過(guò)模型鼠不斷優(yōu)化基因編輯的條件，為將來(lái)能夠應(yīng)用于臨床治療提供堅(jiān)實(shí)的保障[22].