上海市某行政區(qū)空氣中細菌總數(shù)分布與常見致病菌檢測

儲燕萍，趙 望，劉思秀

(1.上海市浦東新區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，上海 200135; 2.復(fù)旦大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200438)

微生物廣泛存在于自然界中，大多數(shù)的空氣微生物能以菌團形式粘附在不同粒徑的顆粒物上，形成微生物氣溶膠[1-4].空氣微生物與人類的生產(chǎn)生活和健康息息相關(guān)，是評估環(huán)境質(zhì)量的重要指標.暴露于高濃度微生物環(huán)境中，可能會傳播病原或引發(fā)過敏性疾病，還會造成食物變質(zhì)、工業(yè)建筑設(shè)備腐蝕等危害[5-11].致病性細菌通常以氣溶膠狀態(tài)存在，人體吸入后易感染氣傳性疾病，造成呼吸道感染、胃炎、肺炎、皮膚炎癥、敗血癥、咽喉炎等疾病[12-14].空氣中微生物濃度越大，造成的健康風(fēng)險越大.傳統(tǒng)地單純依靠少數(shù)理化指標(如TSP、PM10、SO2、NOx)來評價環(huán)境空氣質(zhì)量的優(yōu)劣已經(jīng)不能足夠滿足現(xiàn)代保護環(huán)境和人體健康的要求，因此，及時準確地對空氣中的細菌進行監(jiān)測，對保障環(huán)境安全、預(yù)防氣傳性疾病、保證人體健康具有重要意義[15-18].目前，國內(nèi)對環(huán)境中PM2.5的研究廣泛，但是關(guān)于空氣中細菌水平的研究報道較少[1,5-6,19].

鑒于監(jiān)測空氣中細菌的重大意義，全國各大城市的相關(guān)環(huán)境監(jiān)測部門應(yīng)該把空氣細菌監(jiān)測作為重點內(nèi)容，及時準確地報告空氣微生物含量等數(shù)據(jù)，并嚴格控制空氣微生物含量水平.為了進一步了解空氣中細菌總數(shù)分布及致病性，建立環(huán)境監(jiān)測、空氣微生物含量等數(shù)據(jù)資料，本文對上海市某區(qū)不同功能區(qū)的細菌總數(shù)及相關(guān)病原菌進行了檢測，對不同時間和不同區(qū)域的差異成因進行了初步分析，為城市環(huán)境公共衛(wèi)生狀況及疾病預(yù)防提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

電子天平(BSAl24S,費多利斯科學(xué)儀器北京有限公司,北京)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9123A,上海精宏實驗設(shè)備有限公司,上海)、超凈工作臺(SW-CJ-1D,蘇州)、高壓蒸汽滅菌鍋(BOXUN, China)、恒溫擴增儀(上?？圃措娮涌萍加邢薰咎峁?、瓊脂培養(yǎng)基(Dextrose Agar, Oxoid, UK)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒(New England Biolab)、SYBR Green顯色劑(索萊寶有限公司)、所有其他試劑均購自Sigma，全部引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成.

1.2 監(jiān)測位點的選擇

為了確保監(jiān)測點位采集的樣品具有代表性，在某區(qū)區(qū)域內(nèi)共設(shè)置4個點位.各個點位采樣高度距地面1.2m.其中點位1代表學(xué)校和化工地區(qū)混合區(qū)，點位2代表居民、商業(yè)和學(xué)?；旌蠀^(qū)，點位3代表生物制藥和IT行業(yè)混合區(qū)，點位4代表農(nóng)村地區(qū).

1.3 監(jiān)測方法

環(huán)境空氣中全部細菌的采集： FA-1型六級撞擊式空氣微生物采樣器，采樣流量為28.3L/min，采樣時間為5min，采集體積為141.5L.采樣時間段為2017年7—12月份，每月的中旬連續(xù)5天采集細菌樣品.細菌采樣采用裝有普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平皿[20].采樣后細菌在(37±1) ℃連續(xù)培養(yǎng)48h，用菌落計數(shù)器和放大鏡立即進行平皿菌落的計數(shù).細菌總數(shù)分析方法的技術(shù)依據(jù)是： GB/T 18204.3—2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第3部分： 空氣微生物》——細菌部分.

環(huán)境空氣中部分致病細菌的采集： 青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所制造的嶗應(yīng)2050型空氣智能中流量采樣器，采樣流量為100L/min，采樣時間為8h.采樣濾膜采用石英濾膜，事先經(jīng)400℃高溫烘烤1h.采樣完成后，取1/4張濾膜，轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入12mL無菌生理鹽水，充分反復(fù)洗脫，使過濾物溶于無菌水.將含有過濾物的無菌水置于新的離心管內(nèi)，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，離心時間3min，離心完成后去除上清液.將裝有沉淀物的滅菌離心管置于架子上，向沉淀中加入100μL裂解液，渦旋混勻，在100℃的條件下加熱5min.將離心管置于離心機中，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，離心時間3min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，取5μL加入20μL的LAMP檢測試劑中，63℃反應(yīng)45min，讀取檢測結(jié)果.

空氣中致病細菌的檢測采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)進行，金黃色葡萄球菌擴增的目的基因為耐熱核酸酶基因Nuc，沙門氏菌(鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌)擴增的目的基因為腸毒素基因Stn，通過Primer Explorer V5在線軟件進行引物設(shè)計，通過陽性標準品篩選及其他細菌品種進行特異性鑒定，選擇準確性與特異性最好的引物進行樣品分析，反應(yīng)溫度： 63℃，反應(yīng)時間： 45min.當(dāng)擴增信號拐點時間小于30min時，判斷為樣本中某菌檢出.

1.4 評價標準

評價標準值為中國科學(xué)院生態(tài)研究中心發(fā)布的《大氣微生物評價分級標準》[5,7]，這類評價標準值也是江蘇省目前應(yīng)用的指標.

2 結(jié)果與分析

2.1 某大型城市某區(qū)空氣中細菌的空間變化特征

2017年7—12月，4個點位的微生物監(jiān)測及評價結(jié)果見表1，細菌與微生物總數(shù)分布情況見圖1(第242頁).

表1 點位1～4的細菌監(jiān)測及評價結(jié)果

圖1 該區(qū)2017年7月—12月細菌與微生物總數(shù)分布情況Fig.1 The distribution of total bacteria and microorganisms in this district from July to December 2017

利用平皿菌落計數(shù)監(jiān)測細菌總數(shù)分布現(xiàn)狀，由表1可以看出，點位1細菌總數(shù)只有8月為較清潔，其余月份均為清潔；點位2、點位3、點位4全年都為清潔.2017年全年該區(qū)4個監(jiān)測站點微生物總量的變化范圍是294～1862CFU/m3，低于3000CFU/m3，依據(jù)《大氣微生物評價分級標準》評價，該區(qū)的空氣始終處于清潔水平，空氣質(zhì)量較好.

由圖1可知，該區(qū)各監(jiān)測站點的細菌濃度與微生物總數(shù)無明顯線性相關(guān)關(guān)系.從空間位置看，微生物污染情況與4個點位的地理位置關(guān)系不是非常明顯.相對來說，點位1(學(xué)校和化工地區(qū)混合區(qū))的細菌和微生物水平略高，點位3(生物制藥和IT行業(yè)混合區(qū))的細菌和微生物水平略低.

2.2 該區(qū)空氣中致病菌的檢測結(jié)果

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是生活中常見的致病細菌，能夠引起呼吸道疾病和腸道疾病，本文以這兩種致病菌為標準進行檢測.通過標準株的篩選與重復(fù)驗證，最終檢測引物序列見表2.

表2 用于LAMP的檢測引物

檢測結(jié)果如表3所示.其中“-”表示無樣本，“×”表示未檢出，“√”表示檢出.

表3 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果

根據(jù)表3可知，夏季(7—9月)空氣中檢出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的概率更高.進入秋季(10—12月)，空氣中檢出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的概率逐漸降低.整體看來，4個采樣點秋季檢測的致病細菌概率少于夏季檢測到的致病細菌概率，這可能與夏季溫度更適合細菌繁殖有關(guān)[9,15].

LAMP陽性樣本的驗證結(jié)果如圖2所示，2～6和8～11陽性樣本對應(yīng)的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌電泳條帶呈階梯狀，檢測結(jié)果均為陽性，而陰性對照無階梯狀條帶，與表3結(jié)果相一致。

圖2 LAMP檢測結(jié)果電泳圖Fig.2 The electrophoresis results of LAMPM: DNA Marker;1～6為沙門氏菌檢測。1： 陰性對照；2： 7月點位4；3： 8月點位3；4： 9月點位2；5： 9月點位4；6： 10月點位4；7～11為金黃色葡萄球菌檢測。7： 陰性對照；8： 8月點位1；9： 8月點位2；10： 8月點位3；11： 9月點位4.

此外，從表3中可見金黃色葡萄球菌與沙門氏菌存在的時間與細菌總數(shù)的峰值關(guān)系不明顯.因此，盡管根據(jù)中科院生態(tài)研究中心發(fā)布的大氣微生物評價分級標準，該區(qū)的空氣質(zhì)量狀況為清潔，我們?nèi)砸P(guān)注特殊的致病細菌，避免疾病風(fēng)險.

3 討論與結(jié)論

本文選取了華東某大型城市某區(qū)的4個監(jiān)測站點： 點位1(學(xué)校和化工地區(qū)混合區(qū))、點位2(居民、商業(yè)和學(xué)?；旌蠀^(qū))、點位3(生物制藥和IT行業(yè)混合區(qū))、點位4(農(nóng)村地區(qū)).在2017年7—12月期間，采用FA-1型六級撞擊式空氣微生物采樣器對細菌總數(shù)和微生物總數(shù)進行了監(jiān)測，采用嶗山2050型空氣智能中流量采樣器對4個功能區(qū)的特定致病菌進行了收集并應(yīng)用LAMP檢測方法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌兩種致病菌進行了檢測分析.研究結(jié)果表明，該區(qū)在2017年下半年細菌總數(shù)和微生物總數(shù)基本上都處于清潔級別.盡管細菌總數(shù)和微生物總數(shù)達到標準，該區(qū)仍存在致病菌.致病菌檢測結(jié)果顯示： 夏季空氣中的致病細菌種類較多，進入秋季，空氣中致病細菌種類明顯減少.在夏季樣本中(7—9月)，40%的樣本中檢測出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，進入十月份后，這兩種致病細菌的出現(xiàn)概率大大降低.因此，在日常生活中，有關(guān)部門除了關(guān)注細菌總數(shù)和微生物總數(shù)的變化情況外，也要關(guān)注某些致病菌的存在來避免相關(guān)疾病的發(fā)生.對某些特定區(qū)域，要建立完善的預(yù)警系統(tǒng)，防止傳染性、致病性空氣微生物的傳播，為公眾創(chuàng)造健康、良好的生存環(huán)境.此外，目前我國尚未頒布空氣微生物監(jiān)測分析方法，該領(lǐng)域的技術(shù)方法需進一步完善.