TRAAK離子通道第4次跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)其機(jī)械敏感性的作用

姚富強(qiáng)，潘成芳，閆致強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

鉀離子通道對(duì)于人體的神經(jīng)元放電、心臟跳動(dòng)以及胰島素分泌等生理功能具有非常重要的意義[1].鉀離子通道通常被分成4大類: 電壓門控的鉀離子通道(Voltage-gated K+channels, KV)，鈣離子激活的鉀離子通道(Calcium-activated K+channels, KCa)，內(nèi)向整流鉀離子通道(Inward-rectifying K+channels, Kir)以及雙孔鉀通道(The two-pore four TM segments K+channels， K2P)，前3類通道由4個(gè)亞基組成，每一個(gè)亞基都為組成孔洞提供了一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域[2-3].然而第4類雙孔鉀通道不同于其他類型的鉀通道，雙孔鉀通道的一個(gè)亞基含有兩個(gè)孔道區(qū)(pore helix 1和pore helix 2)，因此雙孔鉀通道是一個(gè)二聚體(dimer)結(jié)構(gòu)而不是四聚體(tetramer)結(jié)構(gòu).雙孔鉀通道的一個(gè)亞基包含4個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，分別是M1、M2、M3和M4，在M1和P1(pore domain 1)之間有一個(gè)特殊的胞外“蓋”(cap)結(jié)構(gòu)[4-6].

最近的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)雙孔鉀通道具有電壓依賴性[4,7]，通道活性受到多種方式的調(diào)節(jié)，包括壓力、溫度、pH、脂質(zhì)以及藥物調(diào)控；雙孔鉀通道主要分成6類，分別是TWIK(Two-P-domain in a weakly inwardly ratifying K+channels)類、TREK(TWIK-related K+channel)類、TASK(TWIK-related acid-sensitive K+channel)類、TALK(TWIK-related alkaline-sensitive K+channel)類、THIK(Tandem pore domain halothane-inhibited K+channel)類以及TRESK(TWIK-related spinal cord K+channel)類[4,8].TREK亞家族通道是目前研究比較深入的雙孔鉀通道，包含TREK-1、TREK-2以及TRAAK通道，它們?cè)谔弁?pain)、膀胱(bladder)以及竇房結(jié)(sinoatrial node)的功能、局部缺血(ischemia)、癲癇(epilepsy)和抑郁癥(depression)等方面扮演著重要的角色[9-16].TREK類通道的活性受到溶血磷脂和花生四烯酸等脂質(zhì)以及pH和揮發(fā)性的氣體麻醉劑等物質(zhì)的調(diào)節(jié)[17-21].TREK亞家族成員(TREK-1、TREK-2和TRAAK)彼此之間可以形成異源二聚體，這些異源二聚體結(jié)構(gòu)種類多樣，使雙孔鉀通道具有了更豐富的功能[22-23].

最近的研究已經(jīng)將人的TRAAK通道(KCNK4)的4種晶體結(jié)構(gòu)解析出來，PDB ID分別為4I9W、3UM7、4RUF、4RUE[6,24-25].晶體結(jié)構(gòu)顯示TRAAK通道是由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基有兩個(gè)孔道區(qū)，兩個(gè)亞基通過在TRAAK通道膜外的“蓋”結(jié)構(gòu)域上形成的二硫鍵連接到一起.根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)的解析結(jié)果，兩種TRAAK通道的門控模型被提出，一種是脂質(zhì)門控模型[24]，另一種是跨膜螺旋伸直(straightening)和彎曲(buckling)的門控模型[25].脂質(zhì)門控模型表明一種脂酰鏈(lipid acyl chain)通過膜內(nèi)一個(gè)寬的側(cè)孔進(jìn)入中心腔，然后在物理上阻塞離子通道，形成封閉狀態(tài)，而跨膜螺旋M4的旋轉(zhuǎn)封住了膜內(nèi)開口，阻止脂質(zhì)進(jìn)入中心腔，從而使離子能夠通過通道進(jìn)行傳導(dǎo)，形成開放狀態(tài).跨膜螺旋伸直和彎曲的門控模型認(rèn)為跨膜螺旋M4的傾斜和伸直伴隨著跨膜螺旋M2的彎曲來激活TRAAK通道.盡管TRAAK通道的4種晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來，但是TRAAK通道的機(jī)械力門控機(jī)制仍然不清楚.上述兩種TRAAK通道門控模型都表明M4能夠影響通道活性，那么M4是否對(duì)TRAAK通道的機(jī)械力門控也具有重要的作用呢？為了研究這個(gè)問題，我們將TRAAK通道的M4區(qū)域與非機(jī)械敏感性通道TWIK-1的同源區(qū)域進(jìn)行替換[26-27].研究發(fā)現(xiàn)TRAAK通道M4的上半部分(PDB: 3UM7[6]，晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列位于248～265aa)對(duì)通道的機(jī)械敏感性具有重要的調(diào)控作用.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自近岸蛋白科技有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基和抗生素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2000bp DNA Marker和Gelstain等化學(xué)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，氯化鉀，HEPES，EGTA等化學(xué)試劑購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自Vian Saga公司；HEK293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞系；pIRES-TRAAK-EGFP和pIRES-TWIK-1-EGFP為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒；引物合成和DNA測(cè)序由上海睿迪生物科技有限公司完成；PrimeSTAR MAX DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒以及同源重組酶CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit等化學(xué)試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000和P3000購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；哺乳動(dòng)物細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，核酸電泳儀和PCR擴(kuò)增儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像儀為Clinx公司產(chǎn)品；數(shù)模轉(zhuǎn)換器、放大器和顯微操作器為AXON公司產(chǎn)品；程控微電極拉制儀為SUTTER公司產(chǎn)品；拋光儀為NARISHIGE公司產(chǎn)品；負(fù)壓儀器Suction Control Pro unit為Nanion公司產(chǎn)品.

1.2 克隆構(gòu)建

嵌合突變體M4-chimera的構(gòu)建： 分別以質(zhì)粒pIRES-TWIK-1-EGFP和pIRES-TRAAK-EGFP為模板，表1中的M4-chimera-F1/R1和M4-chimera-F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到兩個(gè)目的片段，將目的片段進(jìn)行凝膠回收，使用同源重組酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化然后挑菌、搖床培養(yǎng)，通過測(cè)序和序列比對(duì)得到新構(gòu)建的質(zhì)粒；分別以新構(gòu)建的質(zhì)粒和pIRES-TRAAK-EGFP為模板，表1中的M4-chimera-F3/R3和M4-chimera-F4/R4為引物擴(kuò)增得到兩個(gè)目的片段，然后通過凝膠回收、連接和轉(zhuǎn)化等過程得到嵌合突變體M4-chimera.

表1 引物設(shè)計(jì)

嵌合突變體M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的構(gòu)建： 分別以表1中的M4-upper-chimera-F/R和M4-lower-chimera-F/R為引物，以pIRES-TRAAK-EGFP為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，然后通過凝膠回收、連接和轉(zhuǎn)化等過程得到嵌合突變體M4-upper-chimera和M4-lower-chimera.

1.3 HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)： 在顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(細(xì)胞密度均勻，并且細(xì)胞沒有大量聚集在一起)；棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，去除細(xì)胞表面雜質(zhì)；加入1mL濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞開始從培養(yǎng)皿的底部脫落時(shí)，吹打細(xì)胞，將細(xì)胞輕輕懸浮起來；轉(zhuǎn)移細(xì)胞至15mL離心管中，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基加入10%的澳洲胎牛血清和100×的青霉素-鏈霉素)，1000r/min離心3min；棄掉上清，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞；將200μL細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5mL培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞.

HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染： 吸取125μL Opti培養(yǎng)基加入1.5mL EP管中，然后加入3.75μL的Lipo3000，混合均勻；在另一個(gè)EP管中加入125μL Opti培養(yǎng)基，然后加入5μL的P3000和3μg質(zhì)粒，混合均勻；將兩個(gè)EP管中的溶液進(jìn)行混合，室溫靜置5min，然后將混合液加入HEK293T細(xì)胞中.

1.4 電生理實(shí)驗(yàn)溶液成分

細(xì)胞貼附式記錄模式研究TRAAK通道及其突變體半激活壓力值(P50)的電極液和浴液成分.

浴液： 150mmol/L KCl；5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES；pH 7.2(用KOH調(diào)節(jié)pH)

電極液： 142.5mmol/L NaCl；7.5mmol/L KCl；5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES；pH 7.2(用NaOH調(diào)節(jié)pH)

全細(xì)胞的記錄模式研究TRAAK通道及其突變體的全細(xì)胞電流的電極液和浴液成分.

浴液： 142.5mmol/L NaCl；7.5mmol/L KCl；10mmol/L HEPES和5mmol/L EGTA；pH 7.2(用NaOH調(diào)節(jié)pH)

電極液： 150mmol/L KCl；5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES；pH 7.2(用KOH調(diào)節(jié)pH)

1.5 細(xì)胞貼附式記錄

用鑷子夾取細(xì)胞爬片，置于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放在載物臺(tái)上，在顯微鏡下找到細(xì)胞，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好并且?guī)в芯G色熒光的細(xì)胞移至視野中央；用內(nèi)液沖灌器加電極液并趕走氣泡，將電極小心地裝在探頭上；在顯微鏡下找到電極(電極電阻為5～7MΩ)，移至視野中央，將電極入液，點(diǎn)擊膜片鉗放大器(Axopatch 700B amplifier)軟件上的第1個(gè)auto鍵，進(jìn)行液接電位補(bǔ)償；快速移動(dòng)顯微操作器，將電極靠近細(xì)胞，施加負(fù)壓進(jìn)行細(xì)胞封接，形成細(xì)胞貼附式記錄模式，利用Clampex 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析，用負(fù)壓儀器Suction Control Pro unit施加壓力，10mm汞柱為一個(gè)梯度，每次施加壓力時(shí)間為500ms，直到電流達(dá)到最大狀態(tài)后才停止施加壓力.

1.6 全細(xì)胞記錄

待細(xì)胞貼附式記錄模式形成后，用注射器緩慢地將細(xì)胞吸破，此時(shí)仍然保持高阻封接，點(diǎn)擊第2個(gè)auto鍵(膜片鉗放大器軟件第1個(gè)auto鍵的下方)，進(jìn)行快電容補(bǔ)償，點(diǎn)擊第3個(gè)auto鍵，進(jìn)行細(xì)胞電容補(bǔ)償，形成全細(xì)胞記錄模式.

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

利用Clampex 10軟件進(jìn)行電生理數(shù)據(jù)的采集和分析，利用軟件Clampfit 10.4進(jìn)行電生理數(shù)據(jù)處理，包括基線的調(diào)平，假象信號(hào)的去除，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)等；利用GraphPad Prism 6進(jìn)行半激活壓力值(P50值)的計(jì)算，電壓-電流曲線和直方圖的繪制以及曲線的擬合等；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(x±S.E.M)表示，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次，用非配對(duì)t檢驗(yàn)(unpaired t test)的方法統(tǒng)計(jì)野生型和突變體之間的差異.

2 結(jié) 果

2.1 TRAAK通道結(jié)構(gòu)分析以及蛋白序列比對(duì)

盡管K2P通道家族具有結(jié)構(gòu)和序列上的保守性，但是它們卻表現(xiàn)出不同的功能特征[28].結(jié)構(gòu)和序列保守性為在不同的K2P通道之間進(jìn)行嵌合突變提供了可行性.為了探討TRAAK通道機(jī)械敏感性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)信息(PDB: 3UM7[6])將TRAAK通道分成8個(gè)部分： N端(N terminal domain)和第1次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(the first transmembrane domain, M1)；“蓋”結(jié)構(gòu)域(the two-cap domain, Cap)；第1個(gè)孔道區(qū)域(the first pore helix, PH1)；第2次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(the second transmembrane domain, M2)；第3次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(the third transmembrane domain, M3)；第2個(gè)孔道區(qū)域(the second pore helix, PH2)；第4次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(the fourth transmembrane domain, M4)；C端(C-terminal domain)(圖1(a)).本研究首先通過蛋白序列比對(duì)分析得到TRAAK和TWIK-1通道M4區(qū)域上的同源序列(圖1(b))，利用分子克隆，將TRAAK通道M4區(qū)域上的氨基酸序列(PDB: 3UM7[6]，晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列位于248～289aa)替換為TWIK-1上的同源序列，構(gòu)建了嵌合突變體M4-chimera，在細(xì)胞貼附式和全細(xì)胞兩種記錄模式下，研究M4在TRAAK通道機(jī)械力門控中的作用.

2.2 TRAAK通道及嵌合突變體M4-chimera的全細(xì)胞電流和機(jī)械敏感性電流記錄

在全細(xì)胞記錄模式下，我們分別記錄了野生型TRAAK、嵌合突變體M4-chimera和未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的全細(xì)胞電流(圖2(a)、(b)、(c)，見第180頁).與野生型TRAAK通道相比，嵌合突變體M4-chimera的通道活性消失，不能記錄到背景鉀離子電流(圖2(d)、(e)，見第180頁).

在細(xì)胞貼附式記錄模式下，通過負(fù)壓裝置施加壓力，本實(shí)驗(yàn)分別記錄野生型TRAAK和嵌合突變體M4-chimera的機(jī)械敏感性電流(圖3，見第180頁).與野生型TRAAK通道相比，嵌合突變體M4-chimera不能記錄到機(jī)械敏感性電流，暗示M4-chimera是一個(gè)沒有活性的通道.

2.3 TRAAK通道嵌合突變體M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的全細(xì)胞電流記錄

為了進(jìn)一步研究M4在TRAAK通道機(jī)械力門控中的作用，我們將M4分成上半部分(PDB: 3UM7[6]，晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列位于248～265aa)和下半部分(PDB: 3UM7[6]晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列位于266～289aa).與野生型相比，TRAAK通道M4的上半部分被TWIK-1的同源區(qū)域替換之后(嵌合突變體M4-upper-chimera)，產(chǎn)生了較大的電壓依賴性背景鉀電流(圖4(a)、(c)，見第181頁).TRAAK通道M4的下半部分被TWIK-1的同源區(qū)域替換之后(嵌合突變體M4-lower-chimera)，通道活性消失，不能記錄到電壓依賴性背景鉀電流(圖4(b)、(c)，見第181頁)，表明M4的下半部分可能對(duì)通道活性具有重要的作用.

2.4 M4的上半部分對(duì)于TRAAK通道的機(jī)械敏感性具有重要的調(diào)控作用

在細(xì)胞貼附式記錄模式下，本實(shí)驗(yàn)分別記錄嵌合突變體M4-upper-chimera和嵌合突變體M4-lower-chimera的機(jī)械敏感性電流(圖5(a)、(b)，見第181頁).嵌合突變體M4-upper-chimera和野生型TRAAK通道的最大機(jī)械敏感性電流是沒有顯著性差異的(圖5(c)，見第181頁)，但是嵌合突變體M4-upper-chimera的機(jī)械敏感性顯著增強(qiáng)，通道半激活壓力值(P50)從(102.1±5.6) mmHg下降到(54.04±5.7) mmHg(圖5(d)、(e)，P<0.001)，而嵌合突變體M4-lower-chimera不能記錄到機(jī)械敏感性電流，表明M4的上半部分能夠調(diào)控TRAAK通道的機(jī)械敏感性.

3 討 論

機(jī)械敏感性離子通道廣泛存在于真核生物和原核生物之間，能夠?qū)⑼獠繖C(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，參與包括觸覺、聽覺、血壓調(diào)節(jié)等多種生理過程[29].盡管機(jī)械敏感性離子通道具有非常重要的作用，但是人們對(duì)其了解仍然非常少，目前研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)械敏感性離子通道包括OSCA[30-31]，Piezo[32]，TRP[33]，K2P[34-35]，MscL[36]和MscS[37].

不同的機(jī)械敏感性離子通道可能具有特殊的結(jié)構(gòu)區(qū)域調(diào)控其機(jī)械敏感性，例如OSCA通道的M0和M6跨膜螺旋對(duì)通道的機(jī)械敏感性具有重要的作用[30]，并且OSCA通道與鈣離子激活的氯離子通道TMEM16A在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性.在TMEM16A通道中，鈣離子誘導(dǎo)M6跨膜螺旋變直，從而激活TMEM16A通道[38].OSCA通道可能也具有類似的機(jī)制，M6跨膜螺旋變直從而激活OSCA通道[30].K2P通道和TRP通道都具有相似的四聚物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(tetramer topology)，其中K2P通道的一個(gè)亞基包含兩個(gè)孔道區(qū)和兩個(gè)選擇性過濾器[24,39].MscS是七聚體(heptamers)結(jié)構(gòu)[37]，在MscS通道激活過程中，3個(gè)跨膜螺旋發(fā)生了大量的螺旋重排[40].這些機(jī)械敏感性通道，從二聚體蛋白到七聚體蛋白，在結(jié)構(gòu)上有比較大的差異性，然而OSCA通道的電生理特性與TREK類通道具有一定的相似性；與經(jīng)典的機(jī)械敏感性通道Piezo相比，OSCA和TREK類通道都能產(chǎn)生比較大的機(jī)械敏感性電流，P50的閾值也相對(duì)較大[30].本研究發(fā)現(xiàn)，TRAAK通道M4的上半部分對(duì)通道機(jī)械敏感性具有重要的調(diào)控作用，由此推測(cè)OSCA通道M6的上半部分也可能具有調(diào)控該通道機(jī)械敏感性的作用.

TRAAK通道的M4通過構(gòu)象改變，大約在氨基酸殘基G268處發(fā)生旋轉(zhuǎn)，封堵膜內(nèi)開口，阻止脂酰鏈進(jìn)入中心腔，從而使離子能夠進(jìn)入[24]，M4的下半部分可能在M4的旋轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要的作用，通過控制脂酰鏈的進(jìn)入從而影響TRAAK通道的活性.

本研究揭示了TRAAK通道M4的上半部分能夠調(diào)控TRAAK通道的機(jī)械敏感性，但是TRAAK通道作為機(jī)械敏感性離子通道，它感受機(jī)械力的精準(zhǔn)區(qū)域尚不清楚.接下來的研究需要找到TRAAK通道上感受機(jī)械力的結(jié)構(gòu)區(qū)域，進(jìn)一步闡明TRAAK通道感受機(jī)械力的分子機(jī)制，這對(duì)于研究TRAAK通道的機(jī)械力門控機(jī)制是至關(guān)重要的.本研究接下來的主要工作就是要通過一系列的嵌合突變，將TRAAK通道的其他7個(gè)部分(分別是N端-M1、Cap結(jié)構(gòu)、PH1-filter、M2、M3、PH2-filter和C端)，依次用非機(jī)械敏感性離子通道TWIK-1的同源區(qū)域進(jìn)行替換，分別在全細(xì)胞和細(xì)胞貼附式兩種記錄模式下，記錄這些嵌合突變體的全細(xì)胞電流和負(fù)壓激活的電流，研究這些部分在通道機(jī)械敏感性中的作用.這種通過構(gòu)建嵌合突變體研究TRAAK通道機(jī)械力門控機(jī)制的方法，也能夠?yàn)槠渌麢C(jī)械敏感性離子通道的機(jī)制研究提供新的見解與基礎(chǔ).