利福平緩解糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)ONFH的早期軟骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

謝冰勇 陳紫璇 劉扶搖

[摘要] 目的 探討糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GC）對(duì)軟骨細(xì)胞的影響及利福平對(duì)其的保護(hù)作用。 方法 從SD大鼠的膝關(guān)節(jié)分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并用不同濃度的地塞米松（Dexamethasone，Dex）進(jìn)行治療，按照隨機(jī)對(duì)照原則分為三組：NS（Con）組、Dex組和Dex+Rif組，測(cè)量軟骨細(xì)胞中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平和甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）/甲狀旁腺激素相關(guān)肽受體（Parathyroid hormone-related peptide receptor，PTH1R）的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)研究軟骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 GC處理后，軟骨下區(qū)出現(xiàn)空洞軟骨異常，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，同時(shí)通過(guò)GC處理后ROS水平和PTH1R表達(dá)增加。在Dex+Rif組中，利福平保護(hù)了免受Dex誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。 結(jié)論 ROS產(chǎn)生和PTH1R表達(dá)減少可使利福平減輕Dex處理軟骨細(xì)胞的凋亡，軟骨細(xì)胞的大量凋亡可能是早期ONFH的特征性標(biāo)志。

[關(guān)鍵詞] 利福平;糖皮質(zhì)激素;股骨頭壞死;軟骨細(xì)胞

[Abstract] Objective To investigate impacts of glucocorticoids（GC） on chondrocytes and protection effects of rifampicin. Methods Chondrocytes were isolated from the knee joint of SD rats for cell culture and were administered by dexamethasone（Dex） at different concentrations. According to the principle of random control， the cells were randomly divided into three groups： The NS（Con） group， the Dex group and the Dex+Rif group. The level of reactive oxygen species（ROS） and expressions of parathyroid hormone（PTH）/ type 1 PTH-related peptide receptor （PTH1R） in chondrocytes were determined. Expressions of apoptosis-related proteins in chondrocytes were determined by western blot. Results After the treatment of GC， abnormally eroded cavities were formed in subchondral bone， accompanied by elevated osteoclast activity， as well as increased levels of ROS and PTH1R in chondrocytes. Rif protected chondrocytes against Dex-induced cell apoptosis in the Dex+Rif group. Conclusion Rif repressed Dex-induced chondrocyte apoptosis via ROS generation and PTH1R down-regulation. A high amount of chondrocyte apoptosis could be a typical picture of early osteonecrosis of the femoral head（ONFH）.

[Key words] Rifampicin; Glucocorticoids; Osteonecrosis of the femoral head; Chondrocytes

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the femeral head，ONFH）經(jīng)常導(dǎo)致股骨頭的進(jìn)行性塌陷變形[1]，而GC給藥導(dǎo)致的激素性O(shè)NFH是非創(chuàng)傷性中最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素，多發(fā)生于35～55歲的青壯年，男性多于女性[2]。軟骨細(xì)胞的凋亡和壞死等異常情況通常被認(rèn)為是ONFH的特征性標(biāo)志之一。目前，ONFH的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，是國(guó)內(nèi)外骨壞死研究的熱點(diǎn)[3]。在許多研究中已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于GC誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡和壞死等異常情況對(duì)ONFH的影響[14]。Liu LH等[4]通過(guò)在GC誘導(dǎo)的ONFH中，發(fā)現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)之前，可以診斷軟骨壞死，尤其是通過(guò)磁共振成像（MRI），但在早期階段仍沒(méi)有令人滿意的治療ONFH的方法。如果早期階段的變化得到明確說(shuō)明，治療方法及效果將會(huì)更好。由于GC誘導(dǎo)的生長(zhǎng)遲緩與軟骨細(xì)胞的凋亡增加有關(guān)[5]，本研究在ROS水平和PTH/PTH1R與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基礎(chǔ)上，假設(shè)GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS水平升高和PTH1R表達(dá)有關(guān)，通過(guò)體外研究軟骨細(xì)胞，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑和材料

SD大鼠18只、不同濃度Dex（10-7～10-4 M）利福平、10%胎牛血清（FBS）、抗生素DMEM/F12;培養(yǎng)基5×103細(xì)胞/孔、CCK-8（Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan）、PI/Hoechst混合物（Beyotime生物技術(shù)研究所，中國(guó)江蘇）、10 μmol/L DCFH-DA、兔抗鼠Caspase-3抗體、PTH1R抗體、羊抗兔熒光抗體、DAPI;SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺凝膠）。

1.2 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和處理

18只雄性SD大鼠（3月齡，200～250 g）隨機(jī)分成3組，NS（Con）組6只，Dex組6只，Dex+Rif組6只。通過(guò)培養(yǎng)SD大鼠股骨頭軟骨細(xì)胞，取股骨頭軟骨。該程序經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)[SYXK（jiangsu）2016-0028]批準(zhǔn)。根據(jù)夏韶襁等[6]所用的方法從大鼠的膝關(guān)節(jié)分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和治療。將軟骨細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS和抗生素DMEM/F12的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在該研究中，原代細(xì)胞維持在單層培養(yǎng)中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合后，將不同濃度的Dex加入含有或不含利福平的培養(yǎng)基中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞活力測(cè)定

將ROS水平以5×103細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞并使其粘附過(guò)夜，第二天加入Dex，范圍10-7～10-4 M。通過(guò)CCK-8在24 h、48 h和72 h測(cè)量活細(xì)胞量。根據(jù)說(shuō)明書要求，將PI/Hoechst混合物添加到培養(yǎng)板中用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。使用DCFH-DA探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞置于含有或不含有利福平（0.5 μg/mL）的Dex中暴露72 h。暴露后，向培養(yǎng)物中加入10 μmol/L DCFH-DA，然后在黑暗中孵育30 min。用488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量熒光強(qiáng)度。

將細(xì)胞接種在蓋玻片上并在Dex組和Dex+Rif組的Dex中培養(yǎng)72 h并進(jìn)行免疫熒光分析，然后固定細(xì)胞并封閉表位，將兔抗鼠Caspase-3或PTH1R抗體加入細(xì)胞中并在4℃溫育過(guò)夜。然后，加入羊抗兔熒光抗體和DAPI，并在室溫下溫育1 h。通過(guò)顯微鏡（ZEISS，AXIO）觀察樣品。

1.4 提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)印跡分析

通過(guò)SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺凝膠）分級(jí)分離50～100 μg蛋白質(zhì)樣品和western blot[7]使用以下一抗：Caspase-3（1：1000）、Bcl-2（1：1000）、P62（1：1000）、Beclin-1（1：1000）、LC3（1：1000）、PTH1R（1：100）和β-肌動(dòng)蛋白（1：1000）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GC誘導(dǎo)慢性細(xì)胞凋亡、ROS水平及PTH1R表達(dá)的變化

研究caspase-3和Bcl-2的表達(dá)以評(píng)估GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這與軟骨細(xì)胞的體細(xì)胞腔一致，同時(shí)在這些細(xì)胞周圍檢測(cè)到caspase-3的表達(dá)，而Bcl-2的表達(dá)在Dex+Rif組中最低，幾乎不能檢測(cè)到（封三圖3）。另外，數(shù)據(jù)顯示，Dex增加了ROS活性水平，利福平逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)，而在PTH1R的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)了類似的效果（封三圖4）。

2.2 Dex處理對(duì)軟骨細(xì)胞的抑制作用和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用

測(cè)試一系列Dex濃度以確定軟骨細(xì)胞的活力。在48 h處理后，細(xì)胞的存活率在濃度10-4 M的Dex時(shí)顯著降低。但是在濃度10-5 M的Dex處理下，在72 h后觀察到顯著的活力降低，并觀察到細(xì)胞形態(tài)變化（封三圖5-A）。此外，在一系列Dex濃度下研究了細(xì)胞凋亡和自噬標(biāo)志。蛋白質(zhì)印跡分析表明，將蛋白質(zhì)LC-3Ⅱ在85.7%的水平（封三圖5-C）和Caspase-3在70.6%的水平（封三圖5-D），相對(duì)于β-Actin條帶密度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，發(fā)現(xiàn)濃度在0 M到10-5 M Dex時(shí)caspase-3、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白水平以劑量依賴性方式顯著增加（P=0.006），其中LC-3Ⅱ增加約2.2倍，Caspase-3增加約1.8倍（表1），但Bcl-2的表達(dá)相反（封三圖5-B）。

2.3 利福平逆轉(zhuǎn)GC誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、PTH1R表達(dá)的變化

通過(guò)研究利福平對(duì)Dex誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響，將NS（Con）組、Dex組與Dex+Rif組一起培養(yǎng)3 d。如封三圖6-A所示，NS（Con）組和Dex+Rif組軟骨細(xì)胞凋亡率和壞死率均低于Dex組軟骨細(xì)胞（P=0.007），通過(guò)利福平培養(yǎng)時(shí)這些比率顯著下降（P=0.004），進(jìn)一步說(shuō)明利福平逆轉(zhuǎn)了GC誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。同時(shí)，caspase-3的表達(dá)和蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了這種效果（封三圖6-B）。在細(xì)胞凋亡和壞死的進(jìn)程中（封三圖6-C），NS（Con）組的軟骨細(xì)胞凋亡率為0.89%，壞死率為1.75%;Dex+Rif組的軟骨細(xì)胞凋亡率為1.74%，壞死率為2.10%;而Dex組的軟骨細(xì)胞凋亡率高到8.32%，壞死率高達(dá)5.00%，其是Dex+Rif組軟骨細(xì)胞凋亡率的4.78倍，壞死率也達(dá)2.4%。同時(shí)，在10-5 M Dex的處理下（封三圖6-D），Dex組陽(yáng)性軟骨細(xì)胞率均達(dá)到NS（Con）組和Dex+ Rif組的5倍之多（表2）?？梢?jiàn)利福平有效地干預(yù)并降低了糖皮質(zhì)激素Dex誘導(dǎo)的ONFH。另外，通過(guò)研究PTH1R對(duì)軟骨細(xì)胞表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，72 h后，在Dex組中，Dex增加了PTH1R的表達(dá)，而在Dex+Rif組中利福平明顯降低軟骨細(xì)胞中PTH1R的表達(dá)。蛋白印跡數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證實(shí)了這種作用（封三圖7）。

3 討論

據(jù)報(bào)道，Dex處理可增加成骨及軟骨細(xì)胞的凋亡[5]。而除骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞外，GC誘導(dǎo)的ONFH也傾向于發(fā)生軟骨細(xì)胞凋亡[8]，類似的現(xiàn)象在本研究的股骨頭軟骨細(xì)胞中得到證實(shí)。本研究通過(guò)GC治療SD大鼠的股骨頭壞死，沒(méi)有明顯檢測(cè)到空的骨細(xì)胞腔，但發(fā)現(xiàn)軟骨下區(qū)域的軟骨空缺和生長(zhǎng)板的破壞比正常明顯，這不僅可以解釋為骨轉(zhuǎn)換正常，這些變化更可能是由于生長(zhǎng)板的修復(fù)過(guò)程造成的。Iwaniak P等[9]發(fā)現(xiàn)，GC處理后發(fā)生生長(zhǎng)遲緩的特征在于軟骨細(xì)胞的增殖減少及加速膠原纖維的成熟。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)PTH1R的表達(dá)與caspase-3的表達(dá)一致。Dex+Rif組中尤其是軟骨細(xì)胞周圍的caspase-3表達(dá)增加，而Bcl-2的表達(dá)則明顯降低。此外，PTH/PTH1R之間的相互作用平衡對(duì)于軟骨細(xì)胞分化的速度至關(guān)重要。支持PTH/PTH1R在延遲生長(zhǎng)板發(fā)育中的作用，可能是通過(guò)激活cAMP依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。另外，Maycas M等[11]報(bào)道通過(guò)不依賴PTH和依賴性機(jī)制的PTH1R激活，使得在軟骨細(xì)胞中的機(jī)械刺激存活作用中具有重要作用，其受到了PTH治療的同源下調(diào)控制，但不受無(wú)關(guān)的激動(dòng)劑如胰島素樣控制生長(zhǎng)因子（IGF）-I[12]控制。Dex還在成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中上調(diào)PTH1R[13]，這與Dex誘導(dǎo)的ROS應(yīng)激和caspase-3活化與軟骨細(xì)胞中PTH1R的上調(diào)一致?；谝陨蠑?shù)據(jù)，可以假設(shè)GC誘導(dǎo)的軟骨空腔隙破壞以及Bcl-2下調(diào)和軟骨細(xì)胞的凋亡，可以通過(guò)增加PTH1R的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)。另外，評(píng)估ROS水平，發(fā)現(xiàn)GC誘導(dǎo)的ROS應(yīng)激可能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。

另外，Dex10-7～10-4 M的濃度下進(jìn)行測(cè)試發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性對(duì)軟骨細(xì)胞的影響非常高，特別是在10-5 M Dex和10-4 M Dex。評(píng)估ROS水平，發(fā)現(xiàn)GC誘導(dǎo)的ROS應(yīng)激可能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，這與在Dex+Rif組中，利福平逆轉(zhuǎn)Dex誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和ROS水平及PTH1R表達(dá)的增加類似，可見(jiàn)利福平顯示出對(duì)GC誘導(dǎo)的凋亡的拮抗作用（封三圖3），同時(shí)也觀察到ROS水平降低。另外，在細(xì)胞自噬過(guò)程中，薛恩興[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，GC激活軟骨細(xì)胞中的自噬，并同時(shí)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的衰老。細(xì)胞可能在代謝應(yīng)激期間保持活力，自噬被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制[15]。本研究在軟骨細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

最后，本研究也發(fā)現(xiàn)GC處理后軟骨細(xì)胞凋亡與ROS水平和PTH1R的表達(dá)相關(guān)，而GC誘導(dǎo)增強(qiáng)的破骨細(xì)胞活性通常位于這些凋亡的軟骨細(xì)胞周圍。同時(shí)，GC可誘導(dǎo)ROS水平升高，PTH1R表達(dá)和軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生以及周圍破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。然而，隨著PTH1R的上調(diào)和自我修復(fù)能力的增加，骨形成性增加，推測(cè)會(huì)發(fā)生軟骨內(nèi)骨化的恢復(fù)，特別是來(lái)自周圍的軟骨細(xì)胞或生長(zhǎng)板。因此，隨著細(xì)胞凋亡和骨溶解的增長(zhǎng)，壞死區(qū)域最終發(fā)展形成。相反，硬化區(qū)的形成可能是由于PTH1R的上調(diào)和周圍環(huán)境的自我修復(fù)能力。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于利福平緩解糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)ONFH的早期軟骨細(xì)胞凋亡的報(bào)道較少，本研究具有一定的創(chuàng)新性。

總之，GC處理SD大鼠后發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞異常凋亡，利福平減少了Dex誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)生和PTH1R表達(dá)。鑒于缺血誘導(dǎo)和GC誘導(dǎo)的ONFH之間存在密切關(guān)系，因此，軟骨細(xì)胞的大量凋亡可能被認(rèn)為是ONFH早期的特征性標(biāo)志，PTH1R的表達(dá)可能在骨壞死的發(fā)展中起重要作用。

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（收稿日期：2019-11-15）