不同方法干預大鼠腓腸肌急性鈍挫傷模型的實驗觀察

肖 響 張 茜 蘇 波 續(xù) 暢 指導老師:林彩霞 李文迅 李 健

(北京中醫(yī)藥大學，北京，100029)

肌肉損傷無論在軍事訓練、體育鍛煉及日常生活中都十分常見，損傷類型可分為挫傷、牽拉傷和撕裂傷等。其中90%以上的損傷是挫傷或牽拉傷，撕裂傷很少見[1]。肌肉挫傷是由于突然重力直接撞擊導致的肌纖維機械損傷，在運動或非運動損傷中十分常見，并可導致肌肉功能障礙，腫脹、萎縮、攣縮、增加再損傷的可能性等。創(chuàng)傷康復醫(yī)學一直致力于研究促進肌肉損傷快速修復而且功能恢復完全的方法，其最大的難點在于找到一種切實可行的臨床治療方法，既可以增加細胞增殖又可以防止纖維化[2]。目前常用的方法是根據(jù)

RICE[3]原則進行制動、冷敷、加壓、抬高和 24 h內(nèi)冰敷，24 h后熱敷。本文通過觀察不同方法干預對骨骼肌損傷急性期組織修復產(chǎn)生的影響和療效，探尋較好應急處置方法，為肌肉損傷的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 大鼠腓腸肌急性鈍挫傷模型的建立 健康雄性SD大鼠，清潔級，體重(250±20)g，60只。采用定量負荷自由落體打擊的方法制作動物模型。常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房間為每12 h光暗循環(huán)，溫度控制在24℃，食物與水無限制。7 d后用10%的水合氯醛以3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉生效后，測量左后肢小腿周徑并記錄，俯臥位固定于鼠板上，將左后肢褪毛，置于伸膝、踝背屈90度、稍外展位固定，使小腿后群肌置于脛、腓骨內(nèi)側(cè)，腓腸肌暴露清楚。打擊部位取腓腸肌中段。將500 g碼從30 cm高處自由下落，動能為1.47 J，打擊1次，造成大鼠腓腸肌鈍性損傷，形成軟組織損傷動物模型[4]，造模后左后肢明顯腫脹，未見瘀血，無明顯跛行。

1.2 分組 造模后將60只大鼠利用隨機數(shù)字表隨機分為6組:模型組、冰敷組、熱敷組、針刺組、正紅花油組、西藥組。

1.3 干預方法 模型組:不進行任何處理;冰敷[5]組:將碎冰塊裝入塑料袋內(nèi)，在傷處墊薄紗布，用繃帶將冰袋固定在傷處，每次25 min[6]，每日10 時、18時處理，2次/d;熱敷[7]組:在傷處墊薄紗布，在患部進行60℃的水袋熱敷25 min，無熱感時應立即更換，每日10時、18時處理，2次/d;針刺組:取局部、承山、承筋。參照中國針灸學會實驗針灸委員會實驗動物穴位圖譜。方法:皮膚常規(guī)消毒，使用一次性無菌針灸針，規(guī)格0.3 mm×25 mm，刺入受傷肌束內(nèi)，遠近端各一針，留針20 min，行針1次，2次/d;正紅花油組:每日8時、18時涂抹2次正紅花油，清潔傷部皮膚，直接涂于傷處皮膚約1～1.5 cm，輕輕摩擦致藥物吸收;西藥組:在受損部涂抹復方水楊酸甲酯苯海拉明制劑，每日8時、18時涂抹2次，方法同正紅花油組。實驗周期:連續(xù)觀察3 d。

1.4 取材及固定 氯醛以3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，然后取整個腓腸肌，將肌腹正中0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的肌肉放入液氮中，剩余組織固定于4%多聚甲醛固定液中。

1.5 指標檢測 形態(tài)學指標:主要測量大鼠左后肢腓腸肌損傷部位的小腿周徑;采用ELISA法檢測細胞內(nèi)外IL－1、IL－8、TNF含量變化;電鏡觀察:由 oltrolomeNova切片，用日本電子JEOL－1230電鏡分別在2 microns和500 nm的視野下觀察肌原纖維損傷，如肌小節(jié)的變化，Z線M線的變化等。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件分析，計量資料均以(±s)表示，組間數(shù)據(jù)比較進行t檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠小腿周徑變化 結(jié)果顯示造模12 h后各組大鼠左后肢明顯腫脹，各組小腿周徑值增加。干預72 h后各實驗組大鼠周徑數(shù)值均有所下降，腫脹程度略有減輕。涂抹正紅花油組的小腿周徑經(jīng)治療后減小最為顯著，其次是針刺組，其余4組無明顯差別。

2.2 電鏡結(jié)果 圖1、圖2中模型組肌小節(jié)普遍呈梭形，肌節(jié)腫脹，I帶減小，M線溶解，部分肌原纖維斷裂溶解，z線溶解，部分消失。圖3中電鏡下冰敷組肌原纖維未見明顯腫脹，在損傷肌原纖維附近有較多肌質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)。圖4、圖5中熱敷組電鏡下可見部分肌絲斷裂、溶解，肌原纖維腫脹較冰敷、針刺、西藥及正紅花油組明顯。圖6、圖7中電鏡下見西藥組肌衛(wèi)星細胞無改變，肌原纖維形態(tài)正常，未見明顯腫脹。圖8中電鏡下見正紅花油組在肌原纖維損傷部位出現(xiàn)線粒體聚集，肌原纖維形態(tài)正常，肌小節(jié)未見明顯腫脹。圖9、圖10中電鏡下可見針刺組肌原纖維損傷部位聚集較多線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)，正常的肌節(jié)附近有普遍增多的線粒體，同樣范圍內(nèi)肌衛(wèi)星細胞較其他組多3～4倍。

圖1 模型組電鏡下肌原纖維及M線溶解

圖2 模型組電鏡下肌節(jié)腫脹，I帶減小

圖3 冰敷組電鏡下?lián)p傷肌原纖維附近出現(xiàn)較多肌質(zhì)網(wǎng)

圖4 熱敷組電鏡下肌絲斷裂溶解，肌原纖維腫脹

圖5 熱敷組電鏡下肌絲斷裂溶解

圖6 西藥組肌衛(wèi)星細胞

圖7 西藥組正常形態(tài)肌原纖維

圖8 正紅花油組損傷部位線粒體聚集，肌原纖維形態(tài)正常

圖9 針刺組見損傷部位較多線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)聚集

圖10 針刺組較多出現(xiàn)肌衛(wèi)星細胞

2.3 IL－1、IL－8、TNF含量分析 IL－1、TNF水平明顯增高的是正紅花油組，其次是針刺組和冰敷組，2組間無顯著差異，無明顯變化的為熱敷組、西藥組和模型組，此3組間無顯著差異。IL－8水平明顯增高的是正紅花組、針刺組、模型組;西藥組、冰敷組、熱敷組3組無顯著差異，見表1。

表1 各組IL－1、IL－8、TNF含量(n=6，±s)

表1 各組IL－1、IL－8、TNF含量(n=6，±s)

注:與模型組對比，＊＊P＜0.01。

IL－1 IL－8 TNF冰敷組(I) 0.3810±0.052767＊＊ 0.3843±0.023805＊＊ 0.8547±0.03308組別＊＊熱敷組(H)0.2665±0.032917 0.3868±0.063572 0.6217±0.02746西藥組(W)0.2878±0.028868 0.3597±0.041351 0.5537±0.09233正紅花油組(Y)1.0138±0.237952＊＊ 1.2427±0.058442＊＊ 1.4177±0.08505＊＊針刺組(Z) 0.4692±0.027636＊＊ 0.6453±0.045737＊＊ 0.8568±0.09786＊＊模型組(K)0.2435±0.057518＊＊0.4935±0.028048 0.555±0.103000

3 討論

骨骼肌損傷后，其組織修復主要包括炎性反應壞死、組織修復、組織重塑3個過程。近年相關(guān)研究表明，骨骼肌損傷后是可以再生的。骨骼肌組織中的成肌細胞是具有增殖和自我更新能力的細胞，骨骼肌再生主要依賴它的這一功能。一般情況下衛(wèi)星細胞相對靜止和缺乏轉(zhuǎn)錄活性，但在特殊情況下，如負重鍛煉或創(chuàng)傷等，可以被激活進入有絲分裂期、增殖期，并進一步分化融合形成肌管，肌管成熟后形成正常肌纖維，完成修復[8]。而炎性反應因子，在損傷部位發(fā)揮著雙重作用，一方面吞噬壞死細胞和損傷的細胞碎片，另一方面通過分泌生長因子激活肌衛(wèi)星細胞，使其增殖形成新的肌管細胞進而發(fā)育成肌纖維，修復損傷的肌纖維，完成肌肉的再生過程，減少瘢痕組織的出現(xiàn)。適宜的炎性細胞對衛(wèi)星細胞的激活有一定的促進作用，損傷骨骼肌中的衛(wèi)星細胞在傷后的24 h開始出現(xiàn)，但在炎性細胞出現(xiàn)高峰的第2天，其數(shù)量并不多;而在炎性細胞減至適宜數(shù)量的第7天卻大幅度升高并且分化。本實驗主要觀察的炎性反應因子有 IL－1、IL－8和TNF。TNF和IL－1二者都出現(xiàn)在炎性反應早期。冰敷療法的TNF和IL－1水平較模型組高，而IL－8的水平低于模型組，可以說明冰敷減輕肌肉的炎性反應，熱敷會增加炎性反應過程中毛細血管的通透性，使水腫加重，所以電鏡下可見肌小節(jié)腫脹明顯。文獻報道[9]熱敷有消散炎性反應、促進化膿、止痛等作用?？紤]若有出血或瘀血傾向，使用熱敷促進局部血液循環(huán)，則會增加出血或瘀血傾向，從而增加炎性反應，但本實驗中模型未有出血或瘀血的情況，因此熱敷組和模型組對比，熱敷發(fā)揮了其良好的消炎作用。但從骨骼肌損傷后的修復過程與機理來看，局部冰敷、熱敷療法對閉合性鈍挫傷腓腸肌的修復及減少形成瘢痕無實驗依據(jù)和理論支持。針刺組和正紅花油組的3種炎性因子水平均較高，由于對3種炎性因子的監(jiān)測是非動態(tài)的，尚不能明確其變化趨勢，與模型組比較，正紅花油組和針刺組的炎性反應明顯，涂抹西藥組的ELISA結(jié)果顯示3種炎性反應因子水平最低，消炎功效明顯。在骨骼肌鈍挫傷后的72 h內(nèi)應主要為血腫形成、肌肉的壞死、退化以及炎性細胞的浸潤，一般不應出現(xiàn)肌衛(wèi)星細胞的分化。針刺組相同視野內(nèi)肌衛(wèi)星細胞數(shù)量明顯較多，可能說明針刺使肌衛(wèi)星細胞更早的游移至肌原纖維損傷部位?，F(xiàn)有的對針刺治療骨骼肌損傷機制的研究多側(cè)重于針刺對微循環(huán)和血流灌注的影響以及對CaN/NFAT信號通路的激活。研究針刺對炎性反應的作用及對肌衛(wèi)星細胞、線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)等的刺激機制未有明確報道。

本實驗中的造模方法可以成功的復制腓腸肌急性閉合性鈍挫傷模型，損傷部位肌肉腫脹無瘀血。西藥促進炎性反應吸收及消腫作用明顯，但從電鏡下觀察無有助于肌纖維再生的細胞器活動，提示西藥對骨骼肌非瘢痕修復、再生修復可能無作用。正紅花油促進炎性反應吸收效果不佳。損傷后3 d內(nèi)連續(xù)熱敷治療，其促進炎性反應吸收作用較冰敷明顯。除熱敷外，余下4個實驗組的方法均可有效減輕腓腸肌急性鈍挫傷引起的腫脹。針刺可以促進肌衛(wèi)星細胞向骨骼肌損傷部位的游移;針刺可有效地使腓腸肌急性鈍挫傷的損傷處出現(xiàn)大量線粒體聚集，促進肌肉的自身修復，提示針刺可能有抑制瘢痕修復，促進肌肉再生作用。在臨床治療中，不要一味的消腫、消炎，應考慮如何用藥，使肌肉損傷處良性修復、非瘢痕修復，促進肌肉的再生、功能的恢復。

[1]Jarvinen TA，Jarvinen TL，Kaariainen M，et al.Muscle injuries:optimising recovery[J].Best Pract Res Clin Rheumatol，2007，21(2):317－331.

[2]Menetrey J，Kasemkijwattana C，F(xiàn)u FH，et al.Suturing versus immobilization of a muscle laceration.A morphological and functional study in a mouse model[J].Am J Sports Med，1999，27(2):222－229.

[3]魚廣信，鄭宏偉.運動損傷和功能恢復[M].北京:人民體育出版社，2001:37.

[4]Gierer P，Mittlmeier T，Bordel R，et al.Selective cyclooxygenase－2 inhibition reverses microcirculatory and inflammatory sequelae of closed softtissue trauma in an animal model[J].The Journal of Bone and Joint Surgery，2005，87(1):153－160.

[5]扏培九.冷熱療法在運動性損傷中的應用[J].按摩與導引，2004，20(1):41－42.

[6]Cromack d T.Current concepts in wound healing:growth factor and macrophage interaction[J].J Trauma，1990，30(13 Suppl):S129.

[7]Charge SB，Rudnicki MA.Cellular and molecular regulation of muscle regeneration[J].Physiol Rev，2004，84(1):209.

[8]Machida S，Spangenburg EE，Booth FW.Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages[J].Cell Prolif 2004，37(4):267.

[9]薛福連.冷敷、熱敷功效有別[N].醫(yī)藥經(jīng)濟報，2001－006.