食線蟲真菌Duddingtonia flagrans凍干制劑低溫保存后體外殺蟲效果研究

岑曼益，藺國珍，羅斌漢，王逢會，蔡葵蒸＞

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000）

家養(yǎng)反芻動物的消化道線蟲是全世界普遍發(fā)生的主要寄生蟲病，對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。長期以來，隨著驅(qū)蟲藥的廣泛使用，目前體內(nèi)寄生蟲對常用三大類驅(qū)蟲藥（苯并咪唑類、阿維菌素/伊維菌素、左旋咪唑）的抗藥性頻繁發(fā)生且在一些國家和地區(qū)流行并呈蔓延之勢[1-3]。為了阻止寄生蟲抗藥性的繼續(xù)傳播，人們探討利用線蟲的天敵進行生物防治[4]。食線蟲真菌在自然界中作為線蟲的天敵而存在，其中D.flagrans在培養(yǎng)期間能夠產(chǎn)生大量雙層壁的厚垣孢子，能夠抵抗動物消化道內(nèi)的消化酶而不被滅活[5]。目前在國外，D.flagrans作為動物胃腸線蟲生物防治的候選菌種，已取得具有應用前景的成果[6]。研制適宜的劑型對于家畜寄生線蟲的生物防治是非常重要的，這就要求不僅要保持D.flagrans孢子具有穩(wěn)定的活性傳遞到動物的糞便中發(fā)揮有效地捕殺L3作用，而且需適合于投放至飼料中便于飼用、保存和運輸。本研究將D.flagrans厚垣孢子凍干制備成一種生防產(chǎn)品，測定其對動物寄生線蟲的捕殺能力，以便為將來生產(chǎn)中應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

捕食線蟲性真菌D.flagrans分離株（SDH035）是本實驗室自2013年從綿羊糞堆分離純化獲得，GeneBank中18S rRNA、ITS1、5.8 S rRNA、ITS2和28 S rRNA部分序列的登錄號為KY288614.1，菌種（菌種編號：CGMCCNO.11210）保存于中國微生物菌種管理委員會微生物中心，實驗室日常使用的菌種于2 %玉米粉瓊脂（2 % CMA）斜面中4 ℃保存。

1.2 菌種培養(yǎng)及凍干制劑的制備

將保存于2% CMA斜面的培養(yǎng)物，接種于水瓊脂（WA）平板的中央，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。經(jīng)純凈檢查合格后，用無菌手術(shù)刀切取大小約為4 mm×4 mm的小塊，轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平皿的中央，30 ℃培養(yǎng)6 d。然后切取PDA上生長的菌塊（大小約為4 mm×4 mm）轉(zhuǎn)接于含有120 ml沙堡氏肉湯（pH 6.5），置搖床180 rmp、28 ℃避光振蕩培養(yǎng)7 d。將上述培養(yǎng)物旋渦振蕩后，取100 ml接種于含有谷物聯(lián)合培養(yǎng)基的具有細菌濾膜的聚乙烯塑料袋中（玉米660 g，小麥330 g，自來水670 ml，121 ℃高壓滅菌30 min），混勻并火焰密封。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 d，用0.05%滅菌吐溫-80洗脫，旋渦振蕩2～3 min，兩層紗布過濾以除去部分菌絲體，抽樣用血細胞計數(shù)板計數(shù)厚垣孢子的數(shù)量，調(diào)節(jié)厚垣孢子濃度約5×105個/ml，加入與菌懸液等量的凍干保護劑（β-環(huán)狀糊精），置于真空冷凍干燥機中（FD-1C-50型，北京博醫(yī)康實驗室儀器有限公司），在冷阱溫度-45～-50 ℃、真空度8～10 Pa的條件下凍干15 h，先后制備數(shù)批樣品，密封于疫苗瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗動物

從甘肅省榆中縣周圍先后購買3～4月齡、體重17～21 kg（平均體重為18 kg）小尾寒羊12只，按照Cai等[7]的方法，每只試驗綿羊采用丙硫咪唑和左旋咪唑按推薦劑量聯(lián)合驅(qū)蟲1次以驅(qū)除動物體內(nèi)已存在的寄生蠕蟲。7 d后將實驗室保存的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）L3經(jīng)活力檢查合格后，每只試驗綿羊用改良的灌喂裝置（即20 ml注射器連接一個膠管）經(jīng)口灌服10 000條L3，動物每天飼喂苜蓿干草及少量混合精料，自由飲水。接種21 d后，進行糞便蟲卵計數(shù)，以確定感染程度，待試驗綿羊人工感染成功后備用。

1.4 凍干制劑體外殺蟲效果測定

分別取4 ℃保存1年和2年的三批凍干制劑（20161001、20161101和20161102），每批每次測定時用蒸餾水溶解成菌懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)節(jié)孢子濃度約為5×105個/ml。用糞袋收集人工感染綿羊糞便，將糞便碾碎后，按照Cai等[7]所描述的方法，稱取10 g糞便樣品置于直徑為5.5 cm平皿中，試驗組每個平皿加入2 ml的菌懸液，混合均勻，對照組稱取相同量的糞便，加入2 ml蒸餾水（不含真菌）。將上述平皿置于直徑為9 cm平皿中并在該平皿底部添加10 ml左右的蒸餾水以保持培養(yǎng)濕度，平皿加蓋后，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，期間觀察糞便濕度。待培養(yǎng)終止后，按Cai等[8]所描述的方法進行幼蟲分離和計數(shù)，分別計算各組中所獲L3的平均數(shù)，殺蟲率計算公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)處理

體外試驗中，采用SPSS（Version 23.0）軟件計算對照組和試驗組中L3的平均數(shù)，通過方差分析在5%的概率水平判斷差異的顯著性。

2 結(jié)果

三批凍干制劑在4 ℃保存1年時，在體外試驗期間，本制劑中D.flagrans孢子在綿羊糞便中能夠萌發(fā)，試驗組中所獲得的L3平均數(shù)顯著地低于對照組，其對綿羊糞便中L3的減少率分別為90.07 %、86.77 %和83.31 %（見表1）。上述凍干制劑在4 ℃保存2年時，試驗組和對照組所獲得的L3平均數(shù)差異仍顯著，對綿羊糞便中L3的減少率分別為76.61 %、84.59 %和73.04 %（見表2）。從表1和表2可知，在4 ℃貯存條件下保存1年后隨著保存時間的延長，D.flagrans對綿羊糞便中幼蟲的捕殺力有下降趨勢。

表1 4 ℃保存1年后凍干制劑的體外殺蟲試驗

表2 4 ℃保存2年后凍干制劑的體外殺蟲試驗

3 討論

家畜寄生線蟲生防制劑是一種用食線蟲真菌制備的、適用于飼喂動物的且含有活菌的新型獸藥，目前處于探討階段，主要是經(jīng)動物飼用后在糞便中發(fā)揮捕殺幼蟲從而減少感染性幼蟲的作用。為了使該類產(chǎn)品能夠在生產(chǎn)中得到推廣應用，因此研究生防制劑劑型、貯藏方法及保存期是十分必要的。

真空冷凍干燥法對保持微生物分離株特性的穩(wěn)定性有諸多優(yōu)點，可使微生物存活較長時間[8,9]。但食線蟲真菌凍干后作為生防制劑使用，不僅要保持真菌的存活性能，更重要的是要保持其捕食線蟲的能力。目前，關(guān)于D.flagrans凍干制劑保存期效果尚無研究。筆者對含有D.flagrans海藻酸鈉顆粒制劑在4 ℃、-20 ℃、室溫和戶外貯存1年的保存期進行了測定[10]，該制劑在室溫、戶外條件下貯存至少可保持6個月的殺蟲活性。Braga等[11]評估了保存在硅膠粒中的D.flagrans菌種對馬小圓型線蟲感染性幼蟲（L3）捕殺效果，試驗證明在硅膠粒中4 ℃貯存7年仍可存活并對馬小圓型線蟲L3的具有捕食能力。強力節(jié)叢孢菌（A.robusta）的分生孢子冷凍干燥后4 ℃貯存1個月對犬鉤口線蟲（Ancylotoma spp.）L3體外殺蟲率為75.38 %[12]。

綜上所述，D.flagrans凍干制劑在4 ℃貯存條件下至少可保持1年有效的殺蟲活性，這對于含有活菌的生防制劑產(chǎn)品來說已經(jīng)達到了應用于生產(chǎn)實踐中的條件，但制備凍干制劑成本高，限制了今后在寄生蟲生物防治中大規(guī)模應用。目前，在一些熱帶和亞熱帶家畜寄生蟲病常年發(fā)生的國家和地區(qū)，利用當?shù)胤蛛x的D.flagrans分離株研制成的顆粒制劑已進行了田間試驗[13]，但大規(guī)模生產(chǎn)D.flagrans厚垣孢子的問題在全世界尚未突破。我國當?shù)胤蛛x菌株所研制的制劑目前尚未有田間試驗的數(shù)據(jù)，田間試驗需收集較長時期EPG和環(huán)境中感染性幼蟲減少的觀察資料。因此，凍干制劑的田間試驗需要進一步研究。