棕櫚酸對綿羊前體脂肪細胞增殖的影響

盧美琳 ，石嘉琛，王家敏，喬自林

（1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

隨著肥胖和肥胖相關疾病的普遍，脂肪細胞增殖和分化機制引起人們的重視，脂肪前體細胞在經(jīng)歷細胞形態(tài)學和一系列相關基因表達變化后分化為成熟脂肪細胞，三酰基甘油的合成增加，脂質(zhì)積累[1]。PA是一種16碳長鏈飽和脂肪酸，分子式為C16H32O2，在肥胖患者中血液濃度會升高[2]。其是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要成分[3]，在細胞中，該脂肪酸被轉(zhuǎn)化為磷脂，二?；视秃蜕窠?jīng)酰胺。Ahmed B S[4]等研究表明100 uM對牛衛(wèi)星細胞增殖是促進作用，而200 uM是抑制其增殖；因此，在體外培養(yǎng)綿羊前體脂肪細胞時添加不同濃度PA，檢測其對綿羊前體脂肪細胞增殖的影響，為研究能量對肥胖機制提供基礎理論。

1 材料

1.1 主要材料試劑

小尾寒羊前體脂肪細胞，從健康的雌性1日齡小尾寒羊尾部脂肪組織采集經(jīng)培養(yǎng)后液氮中保存，保存的細胞代次為P3代。

DMEM/F12培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物，批號:20190409和20140425)；胎牛血清（FBS）(蘭州民海生物，批號：20141002)；青霉素、鏈霉素、棕櫚酸（純度 ＞98%）均購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（型號為3111）、酶標儀（型號為MK3），均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細胞計數(shù)儀（型號為IC1000），購自Countstar公司；倒置生物顯微鏡（型號為CKX-41），購自Olympus公司。

2 方法

2.1 復蘇前體脂肪細胞

從液氮罐中取出凍存的小尾寒羊前體脂肪細胞，按照常規(guī)方法復蘇細胞，顯微鏡下觀察待細胞基本貼壁后，換新鮮完全培養(yǎng)基，降低DMSO對細胞的損傷，細胞匯合致密單層后續(xù)試驗。

2.2 PA對前體脂肪細胞增殖的影響

待前體脂肪細胞匯合致密單層后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下觀察，待細胞變成透亮的圓形時，加入10 ml完全培養(yǎng)基終止消化，吹打制細胞懸液，取樣計數(shù)。以1×104個/ml的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，放置37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄掉原培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中分別添加濃度為100、150、200、250、300和350 μmol/L的PA，空白對照組只添加等量的完全培養(yǎng)基，而陰性對照組添加終濃度為 0.01%無水乙醇，培養(yǎng)1、3、5、7和9 d后，用MTT法[5]檢測各孔的吸光度值。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Graphpad prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。

3 結果

3.1 復蘇培養(yǎng)

前體脂肪細胞復蘇活率為93%，4 h后貼壁（圖1A），待細胞基本貼壁后，換新的完全培養(yǎng)基，細胞成長梭型，細胞增殖加快，72 h后細胞匯合成單層致密（圖1B）。

圖1 小尾寒羊前體脂肪細胞形態(tài)

圖2 PA對小尾寒羊前體脂肪細胞增殖的影響

3.2 PA對前體脂肪細胞增殖的影響

由圖2可知，PA作用于前體脂肪細胞1 d后，濃度為150 μmol/L可促進細胞增殖，且與對照組相比差異極顯著。作用時間延長至3～9 d后，濃度為100 μmol/L和150 μmol/L均可促進細胞增殖；濃度在200～350 μmol/L均抑制細胞增殖，且各組之間抑制作用差異極顯著。

4 討論

PA的生物學特性和藥理學活性較廣泛，有研究表明PA與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等具有相關性[6-7]；周瑤瑤[8]等研究表明隨著PA濃度的升高抑制Hela細胞增殖更明顯；周光[8]等研究表明0.2 mmol/L PA作用于肝細胞24 h細胞活力降低約50%。該試驗用100、150、200、250、300和350 μmol/L的PA培養(yǎng)綿羊前體脂肪細胞，結果作用1 d后，濃度為150 μmol/L促進細胞增殖；作用時間延長至3～9 d時，100 μmol/L和150 μmol/L均可促進細胞增殖，200～350 μmol/L反而抑制細胞增殖。