MAPK信號(hào)通路基因在雷州山羊不同生長(zhǎng)發(fā)育階段表達(dá)規(guī)律研究

黃 強(qiáng)，陳智成，練志全，鄧 銘，蔡丹鳳，侯云飛，楊健華，李耀坤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

MAPK信號(hào)通路中，Ras/Raf/Mek（絲裂原活化蛋白激酶/Erk激酶）/Erk（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）途徑是控制細(xì)胞增殖、分化和存活的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心[1-3]，主要起正調(diào)控作用；Erk的激活對(duì)細(xì)胞增殖至關(guān)重要[4]；Ras蛋白是Mek/Erk通路的激活因子，不僅能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化[5]，也能促進(jìn)成骨基因表達(dá)和成骨細(xì)胞增殖[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，山羊背最長(zhǎng)肌組織的mRNA組學(xué)特性，在不同發(fā)育階段，呈現(xiàn)明顯的時(shí)序表達(dá)特征[7]。山羊至少有三個(gè)肌發(fā)生波，在胎兒發(fā)育的中后期（85 d左右）肌細(xì)胞明顯增加[8]。動(dòng)物骨骼肌形成和發(fā)育機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，關(guān)于動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育的基因調(diào)控已有很多報(bào)道，但大部分是檢測(cè)單個(gè)基因的在動(dòng)物組織的表達(dá)情況[9]，關(guān)于調(diào)控山羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的通路基因報(bào)道較少。

本次研究通過(guò)分析MAPK信號(hào)通路中Ras/Raf/Mek通路基因在雷州山羊不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期背最長(zhǎng)肌的表達(dá)情況，探究影響雷州山羊背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了雷州山羊胎兒期90 d、100 d、120 d及出生后3月齡、6月齡的雷州山羊背最長(zhǎng)肌的Ras/Raf/Mek通路基因表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究雷州山羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雷州山羊妊娠第90 d、100 d、120 d胎兒各3只，及出生后3月齡、6月齡雷州山羊各2只，由溫氏羊業(yè)有限公司提供。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒（型號(hào)為T(mén)otal RNA Kit II R6934），購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)（型號(hào)為SW-CJ-1B），購(gòu)自中國(guó)蘇凈集團(tuán)；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)為MicroCL 17R），微量核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀（型號(hào)為Nano-200），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)為QuantStudio 7 Flex System），均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

2 方法

2.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用OMEGA Total RNA Kit II R6934試劑盒對(duì)動(dòng)物組織總RNA進(jìn)行抽提，RNA用ND2000超微量核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀檢測(cè)抽提得到的RNA的OD值和濃度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性及是否存在DNA和蛋白質(zhì)的污染。

去DNA反應(yīng)體系：5×DNA Eraser Buffer 2μl，gDNA 1 μl，Total RNA 7 μl。加完后混勻、離心、PCR儀按設(shè)置好的程序運(yùn)行。

反轉(zhuǎn)錄體系為：去DNA反應(yīng)液 10 μl，Prime ScriPt RT Enzyme MixⅠμl，RTPrimer mix 1 μl，5×Primer ScriPt Buffer 4 μl，RNA-free H2O 4 μl。加完后混勻離心，PCR儀按設(shè)置好的程序運(yùn)行。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置-20 ℃冰箱保存。

2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank (httP://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的候選基因序列，以及通過(guò)查詢資料和引用其他文獻(xiàn)資料，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)獲得下列引物，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

本實(shí)驗(yàn)采用SYBRGreen染料法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：上、下游引物各0.3μl，2×SYBRGreen熒光染料5μl，cDNA模板1 μl，加ddH2O補(bǔ)至總體積10 μl；熒光定量PCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5個(gè)循環(huán)（95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s）；58℃檢測(cè)熒光值；15℃保存。

表1 熒光定量Q-PCR所用引物的相關(guān)信息

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以β-Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因的組織表達(dá)譜

采用qRT-PCR技術(shù)，以β-actin作為內(nèi)參，以腎組織為參照，結(jié)果表明（圖1）Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在8個(gè)組織中均有表達(dá)。Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最長(zhǎng)肌和心臟中的表達(dá)量最高，在下丘腦、肝、脾、肺和垂體中的表達(dá)量較低。

圖1 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因的組織表達(dá)譜分析

3.2 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)情況

Ras基因在胎兒發(fā)育120 d齡時(shí)的表達(dá)量最高，表達(dá)模式為：120 d＞100 d＞90 d＞6月齡＞3月齡，120 d齡胎兒背最長(zhǎng)肌中的基因表達(dá)量顯著高于6月齡羔羊。Raf基因在羔羊3月齡的表達(dá)量最高，3月齡羔羊的表達(dá)量顯著高于90 d和100 d胎兒。RafA基因在胎兒發(fā)育120 d齡時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最高，90 d齡的表達(dá)量最低，在出生后6月齡的表達(dá)量高于3月齡，但各組間基因的表達(dá)量差異不顯著。Mek1基因在120 d的表達(dá)量顯著高于其它組，其余組間基因的表達(dá)量差異不顯著。Mek2基因在胎兒期120 d的時(shí)候基因的表達(dá)量最高，120 d的表達(dá)量顯著高于100 d；90 d、100 d、3月齡和6月齡的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著差異（圖2）。

圖2 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)情況

3.3 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在心臟的表達(dá)變化規(guī)律

Ras基因在羔羊3月齡時(shí)的表達(dá)量最高，在胎兒期100 d的表達(dá)量最低，表達(dá)模式為：3月齡＞90 d＞6月齡＞90 d＞100 d，3月齡羔羊心臟中的基因表達(dá)量顯著高于其它組。Raf基因在羔羊3月齡的表達(dá)量最高，100 d齡的表達(dá)量最低，3月齡羔羊的表達(dá)量顯著高于其它組。表達(dá)模式為：3月齡＞6月齡＞120 d＞90 d＞100 d。RafA基因在羔羊3月齡時(shí)表達(dá)量最高，3月齡基因的表達(dá)量顯著高于其它組。Mek1基因在胎兒期120 d的表達(dá)量顯著高于其它組，3月齡和6月齡羔羊表達(dá)量顯著高于胎兒期90 d和100 d。Mek2基因在羔羊3月齡時(shí)基因的表達(dá)量最高，3月齡的基因表達(dá)量顯著高于其它組，90 d、100 d、120 d和6月齡的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著差異（圖3）。

圖3 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在心臟的表達(dá)情況

4 討論

雷州山羊是我國(guó)著名的地方優(yōu)良品種，也是廣東省唯一的肉用羊地方良種。雷州山羊具有瘦肉多、脂肪少、膻味輕、營(yíng)養(yǎng)豐富、味美多汁、易消化吸收等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者青睞[10]，其市場(chǎng)需求量巨大，市場(chǎng)前景十分廣闊，具有較大開(kāi)發(fā)潛力。但近年來(lái)，雷州山羊品種退化十分嚴(yán)重，產(chǎn)肉性能在逐年下降[11]，針對(duì)優(yōu)質(zhì)山羊品種存在的生長(zhǎng)不穩(wěn)定、生長(zhǎng)速度慢等問(wèn)題，本研究通過(guò)分析MAPK信號(hào)通路中相關(guān)基因在雷州山羊各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律，為雷州山羊背最長(zhǎng)肌的生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理的闡明提供證據(jù)，同時(shí)也為肉羊生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。MAPK信號(hào)通路中的Ras/Raf/Mek/Erk細(xì)胞信號(hào)傳遞通路是由一個(gè)GTP結(jié)合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)，其活化的中心是使Ras進(jìn)行鳥(niǎo)苷酸交換變成其活化形式Ras-GTP[12]。該通路可由活性氧、Ca2+、蛋白激酶C等激活，參與體內(nèi)的多種生理生化功能，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、發(fā)育、凋亡均有影響[13]。Ras的表達(dá)對(duì)Raf有促進(jìn)作用，其機(jī)理為Ras-GTP直接與Raf結(jié)合，形成一個(gè)臨時(shí)的膜錨定信號(hào)。而活化的Raf再通過(guò)磷酸化促進(jìn)分裂原激活蛋白激酶的激酶（Mek）環(huán)上的絲氨酸殘基而將其激活[14]。Mek/Erk通路參與了胰島素調(diào)控骨骼肌成肌細(xì)胞增殖，具有促增殖或抗凋亡作用，是多途徑多通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[15]，抑制此通路，可以抑制平滑肌的增殖[16]，也可以抑制骨骼的細(xì)胞增殖、成熟和鈣沉積[17]。小鼠敲除Raf基因?qū)嶒?yàn)表明，Raf基因在各組織生成中均具有一定功能[18]，尤其對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用?；谏鲜鲈?，如果能確定Ras/Raf/Mek信號(hào)通路基因在雷州山羊背最長(zhǎng)肌表達(dá)量的差異和表達(dá)規(guī)律，就可采用基因敲除、轉(zhuǎn)基因、注射抗體、反義核酸等技術(shù)，控制其表達(dá)量，從而使其背最長(zhǎng)肌充分發(fā)育，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。另一方面，通過(guò)有關(guān)基因表達(dá)量與生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律相聯(lián)系，有助于掌握雷州山羊生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)，以便在妊娠母羊胎兒生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期和正常的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期合理調(diào)控外界環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件，充分挖掘其生長(zhǎng)潛能。

雷州山羊的組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因均在雷州山羊的背最長(zhǎng)肌有較高的表達(dá)量，說(shuō)明其對(duì)調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。在心臟組織中，3月齡羔羊的Ras、Raf、RafA和Mek2基因表達(dá)量顯著高于其他組，Mek1在胎兒期120 d表達(dá)量顯著高于其他組。小鼠心臟發(fā)育開(kāi)始于胚胎發(fā)育期的第7.5天，在胚胎第11.5天之后心肌細(xì)胞大量增殖，促心生長(zhǎng)因子有Hedgehog、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPSs)、成纖維生長(zhǎng)因子（firbroblast groth factors, FGFs）和非經(jīng)典Wnt/JNK通路[19]，但關(guān)于山羊心臟發(fā)育過(guò)程中的分子調(diào)控研究報(bào)道較少，本文可為雷州山羊心臟生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供一定的理論參考。在所研究的雷州山羊胎兒期的三個(gè)生長(zhǎng)階段，Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因均在120 d表達(dá)量最高；表達(dá)模式為：120 d＞100 d＞90 d。120 d Mek1基因mRNA的表達(dá)量顯著高于100 d、90 d的基因表達(dá)量山羊妊娠周期為150 d，其胎兒生長(zhǎng)發(fā)育后期（60 d以后）增長(zhǎng)的體重占初生重90%，在妊娠后期胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育速度越來(lái)越快。本研究結(jié)果表明，Ras/Raf/Mek信號(hào)通路基因在雷州山羊的背最長(zhǎng)肌發(fā)育中呈相同的表達(dá)模式，此通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[20]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，雷州山羊在胎兒生長(zhǎng)發(fā)育120 d的時(shí)候有一個(gè)肌肉發(fā)生波。綜合判斷，Ras/Raf/Mek信號(hào)通路在雷州山羊胎兒生長(zhǎng)發(fā)育后期起關(guān)鍵作用，并且起正調(diào)控作用，但具體機(jī)制尚不明確。通過(guò)分析3月齡、6月齡相關(guān)基因表達(dá)情況，并未發(fā)現(xiàn)較明顯的基因表達(dá)模式，可能該通路基因在出生后的調(diào)控機(jī)制發(fā)生了變化，具體的調(diào)控機(jī)制仍有待深入分析。