竹節(jié)參中皂苷含量測定方法的建立

徐怡 張曉南 蘇鈦 冉遠克 游燕

摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）測定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的方法。方法：色譜柱：Waters Symmetry C18 柱（5 μm，4.6×250 mm）;流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液;流速：1.0 mL/min;檢測波長：203 nm。結果 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的線性范圍分別為0.01753ug-1.7531ug（r=1）、0.01754ug-1.7541ug（r=1）、0.04917ug-4.917ug（r=1）、0.0248751ug-0.99486ug（r=1），平均回收率分別為94.68%（RSD=2.45%）、94.71%（RSD=2.82%）、97.92%（RSD=2.08%）、94.80%（RSD=2.41%）。結論 該方法簡便可行，重復性好，可用于測定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro;竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量，為進一步提高竹節(jié)參的質量控制提供依據。

關鍵詞：高效液相色譜法;竹節(jié)參;竹節(jié)參皂苷;含量測定。

中圖分類號：R927.2 ??文獻標志碼：A ??文章編號：1007-2349（2020）01-0067-05

【Abstract】Objective： To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Ro， and ginsenoside IVa in Panax japonicas by HPLC. Methods： Chromatographic column was Waters Symmetry C18 column （5 μm， 4.6 × 250 mm）， mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution， flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength was 203 nm. Results： The linear ranges of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Ro， and Panax japonicas ginsenoside IVa were 0.01753ug-1.7531ug （r=1）， 0.01754ug-1.7541ug （r=1）， 0.04917ug-4.917. ug （r=1） and 0.0248751ug-0.99486ug （r=1） respectively. The average recovery rates were 94.68% （RSD=2.45%）， 94.71% （RSD=2.82%）， 97.92% （RSD =2.08%） and 94.80% （RSD=2.41%） respectively. Conclusion： The method is simple， feasible and reproducible and can be used to determine the content of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Ro in Panax japonicas. The content of saponin Iva in Panax japonicas provides a basis for further improvement of the quality control of Panax japonicas.

【Key words】HPLC， Panax japonicas， Panax japonicas saponin， content determination.

竹節(jié)參收載于1975年及以后歷版《中華人民共和國藥典》，但迄今為止尚未建立含量測定的質量標準。竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參（Panax japonicus C·A.Mey）的干燥根莖，以根狀莖和肉質根入藥，秋季采挖，除去主根及外皮，干燥，其根狀莖稱“竹節(jié)參”，塊根稱“明七”或“白三七”，葉稱“七葉子”。主產于云南、貴州、四川、湖北等省，具有滋補強壯、止血祛痰、消腫鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、抗心肌缺血及降血糖等功效。

筆者參考《中國藥典》以及相關文獻中對竹節(jié)參皂苷成分的研究[1～6]，建立了以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的方法學研究，本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）對竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量進行測定，為評價竹節(jié)參質量及進一步研究提供一定依據，具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國Waters e2695高效液相色譜儀;美國Agilent 1260高效液相色譜儀;SK8200HP型超聲波儀（上?？茖В?AG285型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.1.2 試藥 三批竹節(jié)參由云南白藥集團有限公司提供;對照品人參皂苷 Rg1（批號：110703-201832，純度 92.4%）、人參皂苷 Re（批號：110754-201827，純度93.4%）、人參皂苷 Ro（批號：111903-201604，純度99.9%）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa批號：111861-201001，純度81.2%）均由中國食品藥品檢定研究院提供;所用流動相乙腈，磷酸為色譜純，處理樣品的甲醇為分析純，水為超純水。

1.2 方法與結果

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL中分別含人參皂苷Rg1 1.7531 mg，人參皂苷Re 1.7541 mg，人參皂苷Ro 1.639 mg，竹節(jié)參皂苷Ⅳa1.6581 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內容物，混勻，過二號篩，取0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加60%乙醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，以60%乙醇溶液補足減失重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18 柱（5 μm，4.6×250 mm）;流動相：以乙腈-0.2%磷酸溶液進行梯度洗脫，如下表;流速：1.0 mL/min;檢測波長：203nm;進樣量：10 μL;柱溫在沒有特殊說明的情況下均為25℃，在該色譜條件下，供試品、對照品分離較好，與其他雜質峰均能達到基線分離。

1.2.2 測定法 精密吸取上述溶液10 μL，注入液相色譜儀測定峰面積，以外標法計算，即得。

1.3 分析方法學考察

1.3.1 系統適應性試驗 按供試品溶液制備方法制備供試品溶液按上述色譜條件分別進樣對照品、供試品各10 μL。結果見圖1。由圖譜可以看出供試品溶液色譜中與對照品溶液色譜相應的位置上有相同的色譜峰出現，表明竹節(jié)參中其他成分對竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的的含量測定無干擾。

（1-人參皂苷Rg1，2-人參皂苷Re，3-人參皂苷Ro，4-竹節(jié)參皂苷Ⅳa）1.3.2 線性關系考察 分別精密稱取人參皂苷 Rg1（批號：110703-201832，純度 92.4%）16.20mg，人參皂苷 Re（批號：110754-201827，純度93.4%）16.38 mg，人參皂苷 Ro（批號：111903-201604，純度99.9%）16.37 mg，竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號：111861-201001，純度81.2%）13.46mg置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對照品儲備液（其中人參皂苷Rg11.7531 mg/mL、人參皂苷Re1.7541 mg/mL、人參皂苷Ro1.639 mg/mL、竹節(jié)參皂苷Ⅳa1.6581mg/mL），精密吸取混合對照品儲備液，逐級稀釋，按2.2.1項色譜條件進樣，進樣量10 μL，記錄峰面積，測得結果見表2。以含量（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得人參皂苷 Rg1回歸方程：Y=3654124.82X+4367.50，相關系數r=1，Re回歸方程：Y=2859651X+4135.96，相關系數r=1，Ro回歸方程：Y=5816517.24X+1091.14，相關系數r=1，竹節(jié)參皂苷Ⅳa回歸方程：Y=6867147.66X+4204.46，相關系數r=1。

結果表明，在上述色譜條件下，人參皂苷Rg1在0.01753ug-1.7531ug（r=1）范圍內，人參皂苷Re在0.01754ug-1.7541ug（r=1）范圍內，人參皂苷Ro在0.0248751ug-0.99486ug（r=1）范圍內，竹節(jié)參皂苷Ⅳa在0.04917ug-4.917ug（r=1）范圍內均呈良好的線性關系。

1.3.3 準確度試驗（加樣回收試驗）

1.3.3.1 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷 Rg1（批號：110703-201832，純度 92.4%）、人參皂苷 Re（批號：110754-201827，純度93.4%）、人參皂苷 Ro（批號：111903-201604，純度99.9%）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa批號：111861-201001，純度81.2%）適量，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為人參皂苷 Rg11.7531 mg/mL，人參皂苷Re1.7541 mg/mL，人參皂苷Ro1.639 mg/mL，竹節(jié)參皂Iva1.6581 mg/mL的對照品混合溶液，備用。

1.3.3.2 加樣回收方法 精密稱取9份供試品（批號：云南竹節(jié)參，已測人參皂苷 Rg1含量為0.295%，人參皂苷 Re含量為0.423%，人參皂苷 Ro含量為3.067%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量為0.303%。每份約0.05 g，分別以50%、100%、150%加入上述對照品溶液，然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的溶液按含量測定方法同法測定，計算回收率，結果見表2。人參皂苷Rg1回收率為91.94%～98.11%，人參皂苷Re回收率為91.66%～99.23%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa回收率為90.29%～98.83%（要求均為90%～108%），人參皂苷Ro回收率為95.11%～101.47%（要求為92%～105%），滿足加樣回收率的要求，說明方法準確度良好。

1.3.4 精密度試驗

1.3.4.1 儀器精密度 取配制好的混合對照品溶液（人參皂苷Rg1 0.01753 mg/mL、人參皂苷Re 0.01754 mg/mL，人參皂苷Ro 0.04917 mg/mL，竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.0258715 mg/mL），按“2.2.1”項色譜條件進樣，進樣量10 μL，連續(xù)進樣6針，保留時間及峰面積的RSD值均小于2%，結果表明本法具有良好的儀器精密度。

1.3.4.2 重復性試驗 精密稱取同一批號（批號：云南竹節(jié)參）的樣品6份，按供試品溶液制備方法測定。計算得RSD均小于3%，結果表明本法具有良好的重復性，見表3。

1.3.5 耐用性試驗 在耐用性的考察中對如下可能變動的因素做了考察。

1.3.5.1 柱溫變化 取同一供試品溶液，在不同柱溫下檢測，可以看到溫度變化在±5℃的情況下，對檢測結果沒有影響。

1.3.5.2 穩(wěn)定性試驗 取已配制好的供試品溶液按照含量測定方法依法測定，分別于0、2、4、8、12h進樣，以峰面積計算，結果RSD均小于3%，說明樣品在12 h內是穩(wěn)定的。

1.3.6 樣品測定 取3批樣品按上述供試品制備方法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿的含量，結果見表4。

2 試驗討論

2.1 樣品前處理方法的選擇 提取溶劑的選擇本試驗參照2015版《中國藥典》三七項、珠子參項及文獻，分別考察了采用甲醇、乙醇、60%乙醇直接提取的方法，精密稱定本品0.1 g，置錐形瓶中，分別精密加甲醇25 mL、乙醇25 mL、60%乙醇25 mL，稱定重量，超聲40 min，放冷后加甲醇、乙醇、60%乙醇補重，搖勻，用0.45μm濾膜濾過。取上述供試液10 μL進樣，計算含量，結果表明60%乙醇提取較為完全，所以確定提取溶劑為60%乙醇。

提取方法的選擇：考察了超聲，回流二種方法，結果表明超聲，回流都能有效提取完全，但考慮操作的簡便以及試驗誤差，故確定超聲提取法為提取方法。

提取時間的選擇：精密稱定本品0.1 g，置錐形瓶中，精密加60%乙醇25 mL，稱定重量，分別超聲提取20 min，40 min，60 min，放冷后加60%乙醇補重，搖勻，用0.45μm濾膜濾過。取上述供試液10 μL進樣，計算含量，結果表明超聲40 min已提取較為完全，所以確定提取時間為40 min。

2.2 試驗小結 本試驗建立了高效液相色譜同時測定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的方法。從含量測定試驗結果可以看出該方法的專屬性、重復性、中間精密度、儀器精密度、線性、加樣回收率、范圍試驗等均符合高效液相色譜法對含量測定方法的要求，可以用于竹節(jié)參皂苷的含量測定，為今后質量控制提供了參考。

試驗對三批不同地區(qū)的竹節(jié)參進行了測定。從試驗結果看，人參皂苷Ro是竹節(jié)參皂苷的主要成分，其余人參皂苷Rg1、Re、竹節(jié)參皂苷Ⅳa等皂苷所占比例均不高。云南、湖北、四川地區(qū)竹節(jié)參中皂苷比例相似，不同地區(qū)間的含量有所差別，但是否與地區(qū)差異相關，還需要進一步對多批樣品進行考察。另外，試驗前期也摸索了人參皂苷Rb1的分布情況，但含量較低，故未列入考察。經過文獻查閱，人參皂苷Ro與竹節(jié)參皂苷Ⅳa之間的未知峰可能為竹節(jié)參皂苷Ⅳ，但因未找到對照品，故本次也未列入考察，可以考慮在下一步試驗中進行研究。

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（收稿日期：2019-10-08）