Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化紅葉石楠花色苷提取工藝的研究

肖 莉， 郭雅麗， 程玉蕾， 王 易， 徐丹寧， 徐伊銘 ， 張 邈

(湖州師范學院 生命科學學院， 浙江 湖州 313000)

紅葉石楠為薔薇科石楠屬雜交種的統(tǒng)稱，其新梢和嫩葉含有大量的功能性色素，主要成分為花色苷.臨床研究表明，花色苷具有抗氧化、減少血漿膽固醇、改善血糖、抗炎、心臟保護、肝保護、抗誘變和抗癌等保健功能，可作為功能保健食品的原料，具有較高的經(jīng)濟價值[1-2].目前對紅葉石楠花色苷的研究集中于園林技術(shù)，關(guān)于花色苷提取方法及工藝優(yōu)化的研究還不夠全面.筆者采用超聲波輔助法，對在紅葉石楠葉中提取花色苷的工藝技術(shù)進行研究.該研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，旨在為紅葉石楠花色苷資源的綜合利用提供參考[3-4].

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

紅葉石楠葉，2019年4月采于湖州師范學院東校區(qū)；無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉等為國產(chǎn)分析純.

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

UV1900PCRT雙光束紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)、756 CRT紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、高速多功能粉碎機(上海舍巖儀器有限公司)、抽濾真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、pH計(上海雷磁儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、超聲波清洗器(上海閣凌工業(yè)清洗設(shè)備有限公司)、電子分析天平(Mettler Toledo公司).

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

采摘后的紅葉石楠葉經(jīng)清洗、自然晾干后，置于真空干燥箱內(nèi)干燥24 h，取出粉碎，過60目標準篩，在干燥密閉條件下貯存?zhèn)溆?

1.2.2 紅葉石楠花色苷的提取

準確稱取5.00 g紅葉石楠葉樣品，按比例加入一定濃度的乙醇溶液，在一定的溫度下進行超聲提取，經(jīng)4 500 r/min離心20 min，取上清液備用.

1.2.3 緩沖液的配制[5]

pH 值為1.0緩沖劑的配制：0.2 mol/L的氯化鉀∶0.2 mol/L的鹽酸(25∶67 V/V).

pH 值為4.5緩沖劑的配制：1 mol/L醋酸鈉∶1 mol/L的鹽酸∶水(100∶60∶90 V/V/V).

1.2.4 花色苷最大吸收波長的測定

準確量取5 mL提取液兩份，分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液稀釋定容至25 mL，靜置90 min，利用紫外可見分光光度計在200～700 nm之間分別對提取的原液在pH 1.0和pH 4.5的新鮮紅葉石楠葉提取液中掃描檢測，確定最大吸收波長(λmax).

1.2.5 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定紅葉石楠花色苷含量.分別測定兩份溶液在λmax和λ(700 nm)處的吸光度值，計算△A，根據(jù)公式(1)、(2)計算樣品中花色苷含量.

△A=(Aλmax-A700 nm)pH1.0-(Aλmax-A700 nm)pH4.5，

(1)

花色苷含量(mg/g)=(△A/εL)×M×V×F/W×100.

(2)

式中：ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，為26 900 L/(mol·cm)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量449.2 g/mol；V為最后定容的體積mL；F為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量(g)；L為比色皿的寬度(1 cm).

1.3 單因素實驗設(shè)計

1.3.1 料液比對提取率的影響

稱取5份樣品粉末(每份5 g)，分別以料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)加入50%乙醇，在50 ℃下超聲提取1次，超聲時間為30 min.

1.3.2 提取時間對提取率的影響

稱取5份樣品粉末(每份5 g)，以料液比為1∶20(g∶mL)加入50% 乙醇，在50 ℃條件下超聲提取1次，超聲時間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min.

1.3.3 提取溫度對提取率的影響

稱取5份樣品粉末(每份5 g)，以料液比為1∶20(g∶mL)加入50%乙醇，以50%乙醇為提取劑，料液比為1∶20(g∶mL)，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下超聲提取1次，超聲時間為30 min.

1.3.4 溶劑濃度對提取率的影響

稱取5份樣品粉末(每份5 g)，分別以30%、40%、50%、60%、70%的乙醇為提取劑，料液比為1∶20(g∶mL)，在50 ℃條件下超聲提取1次，超聲時間為30 min.

1.3.5 提取次數(shù)對提取率的影響

稱取3份樣品粉末(每份5 g)，以50%乙醇為提取劑，料液比為1∶20(g∶mL)，在50 ℃條件下分別超聲提取1次、2次、3次，超聲時間為30 min.

1.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，在固定提取溫度50 ℃和提取次數(shù)1次的條件下，選取乙醇濃度、料液比和提取時間3個因素為自變量，由紅葉石楠葉中提取的花色苷含量為指標，設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken試驗，對紅葉石楠花色苷超聲提取工藝進行優(yōu)化.試驗因素和水平編碼見表1[6-8].

表1 響應(yīng)面因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對紅葉石楠花色苷提取的影響

由圖1數(shù)據(jù)可以看出，在料液比低于1∶5時，隨料液比的增加，花色苷的提取率逐漸增大.當料液比達到1∶15時，花色苷的提取率達到最大值9.05 mg/g.進而繼續(xù)增加料液比，花色苷的提取率出現(xiàn)明顯的下降趨勢.這是由于料液比的增加雖然提高了花色苷的溶出，但相應(yīng)也會稀釋花色苷的濃度，從而降低了提取液中花色苷的含量.

2.1.2 提取時間對紅葉石楠花色苷提取的影響

由圖2數(shù)據(jù)可以看出，隨著提取時間的延長，花色苷的提取率逐漸增加，提取時間為30 min時，達到最大提取率9.25 mg/g.進一步延長提取時間，花色苷提取率反而降低，其原因可能是因為長時間超聲加熱破壞了部分花色苷的結(jié)構(gòu).

Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin Fig.2 Effect of time on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 提取溫度對紅葉石楠花色苷提取率的影響

由圖3數(shù)據(jù)可以看出，當提取溫度在30～50 ℃時，隨著溫度的提高花色苷提取率隨之升高.超過50 ℃后上升趨勢下降,其原因可能是過高的溫度導致部分花色苷結(jié)構(gòu)被破壞.因此選擇50℃為最佳提取溫度.

Fig.3 Effect of temperature on the extraction rate of anthocyanin

2.1.4 溶劑濃度對紅葉石楠花色苷提取率的影響

由圖4數(shù)據(jù)可以看出，隨著溶劑濃度的增加，紅葉石楠花色苷提取率逐漸升高；當乙醇體積分數(shù)為50%時，花色苷提取率達到最大，為9.32 mg/g；繼續(xù)提高乙醇體積分數(shù)，花色苷提取率反而下降,其原因可能是花色苷類物質(zhì)極性較強，當提取溶劑極性較大時，雖然有利于花色苷的溶出，但同時也有多糖類雜質(zhì)的溶出，導致提取溶液體系變黏稠，從而抑制了花色苷的溶出.

2.1.5 提取次數(shù)對紅葉石楠花色苷提取率的影響

由圖5數(shù)據(jù)可以看出，隨提取次數(shù)的增加花色苷提取率升高，但升高并不明顯.因此從實驗效果與成本等方面考慮，確定最佳提取次數(shù)為1次.

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計和方差分析

采用Box-Behnken實驗設(shè)計原理，建立料液比(A)、提取時間(B)和溶劑濃度(C)3因素3水平的響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ?實驗安排和實驗結(jié)果見表2.

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

以花色苷含量(mg/g)為指標(R1)，采用Design-expert 8.0.6軟件對響應(yīng)值與各因素進行回歸擬合，得到的回歸方程為：

R1=10.65-0.77A+0.023B+0.21C+0.38AB+0.25AC+0.5BC-2.07A2-1.95B2-2.76C2.

注:*為P<0.05;**為P<0.01;***為P<0.001.

2.2.2 交互作用對花色苷提取率的影響

相對3個單因素中其中的2個因素，通過Design-expert軟件繪制三維響應(yīng)面圖，進一步分析各因素交互作用對花色苷提取率的影響.響應(yīng)面的平緩程度直觀地反映出各自變量發(fā)生變化時花色苷提取率的響應(yīng)靈敏度.

Fig.6 Response surface showing the interactions of two factors on the extraction rate of anthocyanin

圖6中的三維效應(yīng)面可以反映出料液比(A)、提取時間(B)和溶劑濃度(C)的交互作用對紅葉石楠花色苷提取率的影響.AB、AC、BC的曲面坡度較為平緩，故其對紅葉石楠花色苷提取率的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致.

2.3 最優(yōu)方案的驗證

設(shè)置花色苷提取率目標值為最大值，通過Design-Expert軟件分析得到的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為50.6%，料液比為1∶14.05，提取時間為29.9 min，50 ℃下提取1次，花色苷的理論提取率為10.73 mg/g.考慮到實驗的可操作性，最終確定最佳的提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度為51%，料液比為1∶14，提取時間為30 min，50 ℃下提取1次.按此工藝重復3次，得到的花色苷提取率為10.81 mg/g，實測值與預(yù)測值差別不大，說明該工藝穩(wěn)定可靠.

3 結(jié) 論

以紅葉石楠花色苷為研究對象，采用響應(yīng)面分析法對紅葉石楠花色苷的提取工藝進行優(yōu)化，最終獲得紅葉石楠紅色素提取的最佳條件為：乙醇濃度為51%，料液比為1∶14，提取時間為30 min，50 ℃下提取1次，花色苷提取率為10.81 mg/g.

采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法，具有實驗次數(shù)相對較多、考察因素水平范圍相對較大等特點，可以直觀地反映出各個因素對花色苷提取率的影響.由二項式擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)R為0.980 2，說明本次建立的擬合模型較為成功，預(yù)測性良好，能為紅葉石楠花色苷堿的提取與應(yīng)用提供參考.