基于ISSR分子標記的石楠屬植物遺傳多樣性分析

蔣笑麗，章建紅*，李玉祥，王正加

(1.寧波市農業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040； 2.寧波市佳禾生態(tài)科技有限公司，浙江 寧波 315801； 3.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室, 浙江 杭州 311300)

薔薇科Rosaceae石楠屬Photinia在薔薇科中是個大家族，全世界有60多種，我國約有40種，其中大多數(shù)花、葉、果俱美，有較高的觀賞價值[1]。由于其樹形端正，可自然成形，適于公園、花園及路旁交叉點綴，三角地栽植，有時也被用作綠籬、綠屏，因其對二氧化碳、氯氣有較強抗性，且有隔音功能，又可用于街道、廠礦綠化。目前，我國擁有世界上最大的石楠屬植物栽培面積，由于國內綠化苗木產(chǎn)業(yè)長期存在“重引輕育”的現(xiàn)象，其育種和品種改良工作發(fā)展十分緩慢，現(xiàn)有栽培品種均為國外育種專家選育，國內對石楠屬植物的選育和遺傳改良的工作幾乎為零[2-9]。

目前，ISSR分子標記技術已廣泛應用于水稻(Oryzasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、小麥(Triticumaestivum)等作物的品種鑒定、遺傳親緣關系分析和遺傳圖譜構建[10]。然而，該技術應用于石楠屬植物遺傳育種研究卻鮮有報道。ISSR與RAPD相比，其可靠性更高，重復性好，每個引物能產(chǎn)生更高的多態(tài)性；同時，ISSR的操作也簡單。與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、穩(wěn)定、成本較低、DNA用量小，安全性較高[11]。本研究將利用ISSR分子標記技術對18個石楠屬植物樣品進行遺傳多樣性分析，探討其遺傳親緣關系，從而為創(chuàng)新種質資源及選育新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所需試材于2017年5月15日采自浙江寧波與臨安兩地，相關信息見表1。每個樣品采集5個單株的植株嫩葉2片，使每個混合樣品達5 g以上，用生物冰袋保存，帶回實驗室后置于-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料的相關信息

注：采集地浙江臨安的為采自浙江農林大學校園的植物園內，采集地浙江寧波的為采自寧波市農業(yè)科學研究院位于鄞州區(qū)東錢湖鎮(zhèn)高錢村的實驗園區(qū)內。紅葉石楠金鳳凰、石楠幻彩為寧波佳禾生態(tài)科技有限公司自主選育的植物新品種權授權品種，紅葉石楠黃斑、紅葉石楠銀邊、紅葉石楠彩邊均為寧波佳禾生態(tài)科技有限公司自主選育的優(yōu)良株系，尚未申報新品種權，為暫定名。

1.2 DNA提取

參考相關文獻中的CTAB法[12]提取的嫩葉中基因組DNA，純化后分別通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳、分光光度計對其濃度及D值的檢測，電泳條帶單一、清晰明亮，且點樣孔內沒有殘余，則提取的DNA質量較好。

1.3 ISSR引物的篩選及ISSR反應體系的建立

首先選取浙江本地分布的落葉種垂絲石楠與國外引進的常綠種紅葉石楠紅羅賓2個形態(tài)與地理關系差異明顯的DNA，對50個引物進行PCR擴增，篩選出能夠在2份DNA中同時擴增出條帶的引物，然后使用所有試材DNA對上述篩選出的引物再次進行PCR擴增，最后可得到多態(tài)性引物。

PCR體系的總體積為20 μL，其中含DNA模板1 μL(100 ng)，引物0.5 μmol·L-1，Taq0.067 U·μL-1，dNTP 0.2 mmol·L-1, Mg2+2.5 mmol·L-1，10×緩沖液2 μL(所有試劑均購自上海生物工程公司)，ddH2O 12.4 μL。 PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min；于4 ℃保溫，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)，于120 V恒定電壓下電泳30 min之后，在紫外成像系統(tǒng)中觀察照相并保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過對各個引物的ISSR擴增圖譜進行條帶統(tǒng)計，觀察每個引物對18個材料的擴增條帶，記錄該引物在18個材料中不同遷移位置的條帶總數(shù)即為擴增總條帶數(shù)；擴增條帶最少的材料，其條帶數(shù)即為共有條帶數(shù)。多態(tài)性比率=(總條帶數(shù)-共有條帶數(shù))/總條帶數(shù)×100%。在凝膠的同一個位置，出現(xiàn)條帶的記為“l(fā)”，無條帶的記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)表。利用NTSYS計算遺傳相似系數(shù)，用非加權成組配對算數(shù)平均法(UPGMA)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)進行聚類分析[13]。

2 結果與分析

2.1 DNA的檢測

圖1為18個石楠屬植物樣品提取的DNA電泳圖，在電泳圖中條帶清晰，亮度高，無明顯拖尾和彌散現(xiàn)象，DNA完整性較好，無降現(xiàn)象，提取的純度較好。如果點樣孔中近有少許亮帶存在，說明提取的基因組DNA中仍有大分子物質存在沒有被去除。

2.2 多態(tài)性

對50個ISSR引物進行初篩，最終篩選出9條引物用于所有樣品擴增，共獲得54條譜帶，其中50條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為92.59%。其中圖2為57號引物對18個石楠屬植物樣品DNA擴增的譜帶情況。9條引物平均每對引物擴增出譜帶6條，平均5.6條具有多態(tài)性(表2)。

圖1 18個石楠屬植物樣品的DNA電泳結果

圖2 57號引物ISSR擴增的譜帶

表2 ISSR引物的擴增結果

2.3 聚類

基于9個引物的擴增結果數(shù)據(jù)，通過聚類分析得到各樣品間相似系數(shù)為0.28～0.90，從表3可知，小葉石楠與傘花石楠相似度達0.9，親緣關系最近；其次是紅葉石楠銀邊與小葉紅葉石楠相似度0.88；親緣關系最遠的是紅葉石楠銀邊和短葉石楠，相似度僅0.28。從圖3中可以看出，在相似系數(shù)0.60左右的位置可以將18個石楠屬植物樣品分為5大類：Ⅰ類為欏木石楠、垂絲石楠、小葉石楠、傘花石楠、絨毛石楠、玉蘭葉石楠；Ⅱ類為中華石楠、光葉石楠、羅城石楠；Ⅲ類為石楠、紅葉石楠紅羅賓、紅葉石楠黃斑、紅葉石楠銀邊、紅葉石楠彩邊、小葉紅葉石楠；Ⅳ類為短葉石楠；Ⅴ類為石楠幻彩、紅葉石楠金鳳凰。從聚類分析樹狀圖中可以看出，這5類遺傳距離較遠，說明它們的親緣性也較遠。

表3 18個石楠屬植物樣品的相似系數(shù)

圖3 基于ISSR分子標記的18個石楠屬植物試材的聚類樹

3 小結與討論

遺傳多樣性是生物種質資源多樣性的主要評價內容，可為其遺傳育種提供依據(jù)。本研究使用9個ISSR引物對18個石楠屬植物進行了遺傳多樣性分析，從聚類分析圖看出，在遺傳相似系數(shù)為0.6時，18個石楠屬植物被分為5類；并且9個引物擴增共獲得54條帶，其中有50條具有多態(tài)性，說明石楠屬植物的遺傳多樣性較高。另外，聚類分析結果表明，不同石楠屬植物間的遺傳差異較大，ISSR相似系數(shù)為0.28～0.90，小葉石楠與傘花石楠遺傳距離最近，兩個標記的相似度均最高，因為小葉石楠與傘花石楠形態(tài)上最為接近，兩者均為傘形花序，花量極少，而其他石楠屬植物為傘房或復傘房花序，且花量多，因而與其有明顯區(qū)別。從遺傳距離的遠近與地理種源的相關性來看，國外引進的紅葉石楠系列品種能較好地聚在一起，短葉石楠產(chǎn)于貴州，而其他石楠屬植物在浙江均有分布，因而短葉石楠與其他國內種的石楠屬植物遺傳距離也較遠，說明了石楠屬植物的遺傳親緣關系與地理種源分布存在緊密聯(lián)系。

紅葉石楠是石楠雜交種的統(tǒng)稱，紅葉石楠是石楠雜交種，因而其系列品種與石楠聚合成一組；欏木石楠是常綠小喬木，與垂絲石楠、小葉石楠、傘花石楠、絨毛石楠、玉蘭葉石楠等落葉灌木聚在一起；而中華石楠為落葉灌木，又和光葉石楠、羅城石楠等常綠灌木聚在一起，說明石楠屬植物親緣關系的遠近與常綠和落葉、喬木還是灌木并沒有完全

的相關性。

總之，本研究結果表明，ISSR分子標記技術在石楠屬植物的基因型差異上表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，能夠更好地分析石楠屬植物的遺傳多樣性和親緣關系。另外，聚類分析的結果從分子水平上印證了這些石楠屬植物之間的遺傳親緣關系，能夠為后續(xù)石楠屬植物雜交育種中親本選配提供一定的參考依據(jù)。