新型TOPK抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究

黃珍 方宇希 黃志勇 李榮東

〔摘要〕 目的 將TOPK抑制劑OTS514的母核噻吩并[2，3-c]喹啉酮環(huán)替換成喹唑啉，探究含有喹唑啉的新型TOPK抑制劑的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。方法 以O(shè)TS514作為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)并合成一系列4-氨基喹唑啉衍生物。采用MTT法測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)肺癌細(xì)胞（A549）和乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）的抗增殖活性。結(jié)果 合成了16個(gè)未見報(bào)道的新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和高分辨MS確證。手性因子對(duì)抗腫瘤活性影響不明顯，暴露的氨基能增強(qiáng)化合物的抗腫瘤活性。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，化合物12a-12f的活性與OTS514相當(dāng)。結(jié)論 新骨架的TOPK抑制劑具有和OTS514相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性，為進(jìn)一步探索含有喹唑啉藥效團(tuán)的TOPK抑制劑研究打下了基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 TOPK抑制劑;抗腫瘤藥;喹唑啉;合成

〔中圖分類號(hào)〕R914.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.010

〔Abstract〕 Objective To investigate the anti-tumor cell proliferation activity of a novel TOPK inhibitor containing quinazoline， the parental thiophene [2，3-c] quinolinone ring of TOPK inhibitor OTS514 was replaced by quinazoline. Methods A series of 4-aminoquinazoline derivatives were designed and synthesized with OTS514 as the lead compound. MTT method was used to test the antiproliferative activity of the target compound on lung cancer cells （A549） and breast cancer cells （MDA-MB-231）. Results Sixteen new compounds were synthesized and their structures were confirmed by 1H NMR and high-resolution MS. The effect of chiral factors on antitumor activity was not obvious， and the exposed amino group can enhance the antitumor activity of the compounds. The antitumor activity of compound 12a-12f in vitro was similar to that of OTS514. Conclusion The new skeleton TOPK inhibitor has the same antitumor activity as OTS 514， which lays a foundation for further study of TOPK inhibitors containing quinazoline pharmacophore.

〔Keywords〕 TOPK inhibitors; antineoplastic agents; quinazoline; synthesis

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。目前，它們已超越其他疾病，成為變色的“頭號(hào)殺手”[1]。與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，靶向抗腫瘤藥物具有提高療效、提高藥物選擇性和患者依從性等優(yōu)點(diǎn)，已成為抗腫瘤藥物的重要研究方向[2-3]。TOPK，也稱為PBK或PDZ結(jié)合激酶，是MAPKK蛋白家族的成員[4-5]。它是一種絲氨酸蘇氨酸絲裂原激活蛋白激酶，在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤、白血病、黑素瘤、膽管癌和膠質(zhì)瘤等多種人類癌癥中高度表達(dá)[6-14]。TOPK可能是藥物開發(fā)的一個(gè)有前途的分子靶點(diǎn)，它涉及多種細(xì)胞功能，包括腫瘤發(fā)展、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和炎癥[15-18]。 ? ? ? ? ? 根據(jù)TOPK抑制劑的作用機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TOPK抑制劑的3環(huán)芳香環(huán)結(jié)構(gòu)是其抗腫瘤活性的關(guān)鍵，側(cè)鏈的改變可能改變藥物的選擇性，如：HI-TOPK-032[19]可有效抑制PBK/TOPK激酶的活性，對(duì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、氨基末端激酶和p38 蛋白激酶（p38 kinase activities）等激酶影響較弱;HI-TOPK-032可通過減少ERK-RSK磷酸化達(dá)到抑制貼壁依賴型和非依賴型結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但是現(xiàn)有的PBK/TOPK抑制劑存在一定的缺陷：（1）分子中的3個(gè)或者4個(gè)芳香性結(jié)構(gòu)片段具有較強(qiáng)的脂溶性，因此其理化性質(zhì)在成藥性上存在一定的技術(shù)缺陷。（2）該類藥物具有血液毒性反應(yīng)，雖然把藥物包裹在脂質(zhì)體中能夠有效避免毒性反應(yīng)，但是仍存在用藥安全性問題。

考慮到7-羥基-苯并咪唑類化合物和噻吩并[2，3-c]喹諾酮類化合物具有抑制TOPK激酶活性，采用骨架躍遷原理，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。將噻吩并[2，3-c]喹諾酮環(huán)替換成喹唑啉環(huán)。通過計(jì)算機(jī)模擬化合物12f與TOPK的活性位點(diǎn)對(duì)接，發(fā)現(xiàn)化合物12f與TOPK的ARG-101和GLU-116形成氫鍵，從而表現(xiàn)出對(duì)TOPK的抑制作用。見圖1。

目標(biāo)化合物11a-11j和12a-12f合成方案見圖2。以2-苯基-1-丙胺的混旋、R、S構(gòu)型和1-苯基乙胺的混旋、R、S構(gòu)型為原料合成關(guān)鍵中間體4;以6-羥基-7-甲氧基-4-酮喹唑啉為起始原料經(jīng)過乙?；吐然玫街虚g體7。將中間體4和7對(duì)接得到化合物8，在其6位上修飾得到化合物11a-11j。將化合物11e-11j再進(jìn)一步脫去乙?；玫侥繕?biāo)化合物12a-12f。

1 儀器與試藥

YRT-3型熔點(diǎn)儀（天津海益達(dá)科技有限公司）;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）;ZF7三用紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限公司）;Water Xevo G2-XS TOf質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）;核磁共振波譜儀AVANCE III HD 600（德國(guó)布魯克公司）;Multiskan MK3多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）;A549人肺癌細(xì)胞株（上海酶研生物科技有限公司）;MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株（上海酶研生物科技有限公司）;吉非替尼（Solarbio公司）。

實(shí)驗(yàn)所有試劑均為市售得分析純或化學(xué)純，所有試劑使用前都未作處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 ?目標(biāo)化合物的合成

2.1.1 ?N-（2-苯基丙基）乙酰胺（2）的制備 ?2-苯基-1-丙胺（13.5 g，0.1 mol）溶于二氯甲烷中（54 mL），在0 ℃滴加乙酸酐（8.6 mL，0.092 mol）的二氯甲烷（70 mL）溶液，攪拌反應(yīng)30 min，再室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。向反應(yīng)液中加入二氯甲烷（45 mL）和2% NaOH溶液（50 mL），分出有機(jī)相，水（100 mL×2）洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收二氯甲烷，得淡黃色油狀液體12.15 g，收率： 68.9%。HRMS（ESI）Calcd for C11H14N2O3[M+H]+177.1145， found 177.1136。

2.1.2 ?N-[2-（4-硝基苯基）丙基]乙酰胺（3）的制備 ?N-（2-苯基丙基）乙酰胺（9.0 g，0.051 mol）-5 ℃滴加混酸11 mL（98%硫酸∶68%硝酸=6∶5），滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)1 h，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。倒入冰水中，二氯甲烷 （40 mL×3）提取，分出有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除二氯甲烷，得到黃色固體產(chǎn)物8.0 g，收率：70.9%，m.p.83.5～84.3 ℃。HRMS（ESI）Calcd for C11H14N2O3[M+H]+222.1054， found 222.1056。

2.1.3 ?N-[2-（4-氨基苯基）丙基]乙酰胺（4）的制備 ?N-[2-（4-硝基苯基）丙基]乙酰胺（11.1 g，0.05 mol）、無(wú)水乙醇（92 mL）、活性炭（0.92 g，0.078 mol）和六水合三氯化鐵（0.23 g，0.001 mol）88 ℃攪拌30 min，滴加80%水合肼（7.6 mL，0.13 mol），繼續(xù)回流反應(yīng)6 h，趁熱抽濾，減壓蒸除無(wú)水乙醇，二氯甲烷 （40 mL×3）提取，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除二氯甲烷，得粗產(chǎn)物柱色譜純化（乙酸乙酯∶石油醚=4∶1），得7.0 g黃色油狀物，收率：73.1%。HRMS（ESI）Calcd for C11H16N2O[M+H]+193.1296， found 193.1305。

2.1.4 ?7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉（7）的制備 ?6-羥基-7-甲氧基-4-酮喹唑啉（16.7 g，0.1 mol）、乙酸酐（125 mL，1.3 mol）和吡啶（16.7 mL，0.22 mol）100 ℃攪拌30 min，加入4-二甲氨基吡啶（0.75 g，0.006 mol），繼續(xù)攪拌6 h，停止反應(yīng)，減壓蒸除乙酸酐，加入大量冰水?dāng)嚢?，抽濾，烘干，得黃白色固體。將其加至氯化亞砜（158 mL，2.1 mol）中，80 ℃攪拌，再緩慢滴加N，N-二甲基甲酰胺（6.2 mL，0.08 mol）。6 h后停止反應(yīng)。減壓回收氯化亞砜，加入少量甲苯攪拌，再減壓回收甲苯。將反應(yīng)物倒入冰水中，抽濾，得灰白色固體17.9 g，收率： 82.3%[24]。

2.1.5 ?4-[4-（2-乙酰胺基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-乙酰氧基喹唑啉（8）的制備 ?N-[2-（4-氨基苯基）丙基]乙酰胺（9.5 g，0.05 mol）、異丙醇 （59.5 mL）和7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉（11.2 g，0.043 mol）90 ℃加熱反應(yīng)4 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)，抽濾，濾餅用少量異丙醇洗滌，烘干，得淡黃色固體15.2 g，收率：75.3%，m.p.>200 ℃。HRMS（ESI）Calcd for C22H24N4O4[M+H]+ 409.1847， found 409.1856。

2.1.6 ?4-[4-（2-乙酰胺基-1-甲基乙基）苯氨基]-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（9）的制備 ?4-[4-（2-乙酰胺基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-乙酰氧基喹唑啉（8.4 g，0.02 mol）和甲醇（60 mL）升溫至70 ℃攪拌，加入氨水（5.8 mL，0.15 mol），溶液由渾濁變澄清，繼續(xù)反應(yīng)4 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。減壓回收甲醇，得黃色油狀物。加入丙酮（15 mL），升溫至65 ℃回流，出現(xiàn)黃白色固體，停止反應(yīng)，過濾，得黃白色固體6.7 g，收率：88.9%，m.p.183.2～188.6 ℃。HRMS（ESI）Calcd for C20H22N4O3[M+H]+367.1638， found 367.1643。

2.1.7 ?4-[4-（2-乙酰胺基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-氯丙氧基）喹唑啉（10）的制備4-[4-（2-乙酰胺基-1-甲基乙基）苯氨基]-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（7.4 g，0.02 mol）、N，N-二甲基甲酰胺（74 mL）、碳酸鉀（4.2 g，0.03 mol）和少量碘化鉀，75 ℃攪拌20 min，加入1，3-溴氯丙烷（2.2 mL，0.023 mol），繼續(xù)反應(yīng)5 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。加水100 mL，攪拌有固體析出，抽濾得粗產(chǎn)品，丙酮重結(jié)晶得到黃色固體7.4 g，收率：83.0%，m.p.175.3～176.2 ℃。HRMS（ESI）Calcd for C23H27ClN4O3[M+H]+443.1820， found 443.1826。

2.1.8 ?目標(biāo)化合物11f的合成 ?4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（3.6 g，0.01 mol）、N，N-二甲基甲酰胺（45 mL）、碳酸鉀（2.0 g，0.014 mol）和少量碘化鉀95 ℃攪拌，再緩慢加入N-（3-氯丙基）-二丁基胺（2.72 mL，0.011 mol），繼續(xù)反應(yīng)6 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。加水150 mL，攪拌有固體析出，抽濾得粗產(chǎn)品。在室溫下，將粗產(chǎn)品溶于丙酮，緩慢滴加鹽酸，攪拌有固體出現(xiàn)，抽濾，得淡黃色固體4.2 g，收率：77.8%。

目標(biāo)化合物11a-11j的合成方法參照上述方法。

2.1.9 ?目標(biāo)化合物12a的合成 ?4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（1 g，0.002 mol）和1N HCl（5 mL）依次加入到100 mL的圓底燒瓶中。升溫至95 ℃回流反應(yīng)48 h，HPLC監(jiān)控檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。減壓蒸餾，用少量無(wú)水乙醇多次洗滌，繼續(xù)減壓蒸除無(wú)水乙醇，真空干燥得黃白色固體0.7 g，收率：77.8%。

目標(biāo)化合物12a-12f的合成方法參照上述方法。

2.2 ?目標(biāo)化合物的圖譜數(shù)據(jù)

2.2.1 ?（S）-4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（1-六氫哌啶基）丙氧基）喹唑啉（11a） ?淡黃色固體，收率 58.0%，m.p.160.2～163.3 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.35 （s， 1H）， 7.78 （s， 1H）， 7.63 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.28 （d， J = 8.5 Hz， 2H）， 7.15 （s， 1H）， 4.30 （t， J = 5.7 Hz， 2H）， 3.99 （s， 3H）， 3.37-3.32 （m， 2H）， 3.19-3.06 （m， 6H）， 3.00-2.96 （m， 1H）， 2.30-2.26 （m， 2H）， 1.90 （s， 3H）， 1.86-1.79 （m， 4H）， 1.27 （d， 3H）， 1.20-1.04 （m， 1H）， 0.96-0.76 （m， 1H）. HRMS（ESI）Calcd for C28H37N5O3[M+H]+492.2939， found 429.2930。

2.2.2 ?（S）-4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（1-四氫吡咯基）丙氧基）喹唑啉（11b） ?淡黃色固體，收率57.0%，m.p.153.1～154.3 ℃。1H NMR（600 MHz， MeOD） δ 8.42 （s， 1H）， 7.90 （s， 1H）， 7.66 （d， J = 8.3 Hz， 2H）， 7.30 （d， J= 8.5 Hz， 2H）， 7.18 （s， 1H）， 4.39 （t，J = 5.4 Hz， 2H）， 4.03（s， 3H）， 3.51 （t， J = 7.1 Hz， 2H）， 3.39-3.33 （m， 2H）， 3.23-3.18 （m， 4H）， 3.01-2.97 （m， 1H）， 2.41-2.34 （m， 2H）， 1.90 （s， 3H）， 1.33-1.31（m， 4H）， 1.28 （d， J = 4.1 Hz， 3H）。HRMS（ESI）Calcd for C27H35N5O3[M+H]+478.2813， found 478.2805。

2.2.3 ?（S）-4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二甲胺基）丙氧基）喹唑啉（11c） ?淡黃色固體，收率：65.0%，m.p.137.2～139.6 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.34 （s， 1H）， 7.71 （s， 1H）， 7.62 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.27 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.11 （s， 1H）， 4.23 （t， J = 6.0 Hz， 2H）， 3.98 （s， 3H）， 3.41-3.32 （m， 2H）， 3.00-2.95 （m， 1H）， 2.79 （t， J =7.5Hz， 2H）， 2.47 （s， 6H）， 2.17-2.11 （m， 2H）， 1.90 （s， 3H）， 1.28 （d， J = 7.0 Hz， 3H）。HRMS（ESI）Calcd for C25H33N5O3[M+H]+ 452.2653， found 452.2660。

2.2.4 ?（S）-4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（1-嗎啉基）丙氧基）喹唑啉（11d） ?白色固體，收率：70.2%，m.p.168.4～170.0 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.65（s， 1H）， 8.17 （s， 1H）， 7.70 （d， J = 8.3 Hz， 2H）， 7.36 （d， J = 8.3 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 4.45 （t， J = 5.4 Hz， 2H）， 4.10 （d， 2H）， 4.08 （s， 3H）， 3.89 （t， J = 11.9 Hz，3H）， 3.66 （d， J = 12.4 Hz， 2H）， 3.48 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 3.37 （d， J = 7.4 Hz， 2H）， 3.24 （td， J = 12.3， 3.4 Hz，4H）， 3.07-3.00 （m， 1H）， 2.47-2.41 （m， 2H）， 1.93 （s， 3H）， 1.30 （d， J = 7.0 Hz， 3H）。HRMS（ESI）Calcd for C27H35N5O4[M+H]+494.2709， found 494.2703。

2.2.5 ?（S）-4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（11e） ?灰白色固體，收率： 76.0%，m.p.155.4～156.8 ℃。 1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.66 （s， 1H）， 8.20 （s， 1H）， 7.70 （d， J = 8.1 Hz， 2H）， 7.36 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.28 （s， 1H）， 4.43 （t， J = 5.2 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H）， 3.47 （t， J = 7.7 Hz，2H）， 3.40 （d， J = 6.8 Hz， 2H）， 3.25 （t， J = 8.3 Hz， 4H）， 3.07-3.02 （m， 1H）， 2.42-2.31 （m， 2H）， 1.96 （s， 3H）， 1.83-1.70 （m， 4H）， 1.51-1.41 （m， 4H）， 1.30 （d， J = 7.0 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C31H45N5O3 [M+H]+536.3588， found 536.3597。

2.2.6 ?4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（11f） ?灰白色固體，收率： 77.8%，m.p.155.4～157.9 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.36 （s， 1H）， 7.77 （s， 1H）， 7.63 （d， J = 8.2 Hz， 3H）， 7.28 （d， J = 8.2 Hz， 3H）， 7.14 （s， 1H）， 4.28 （t， J = 5.5 Hz， 2H）， 3.99 （s， 3H）， 3.45-3.32 （m， 2H），3.09 （t， J = 6.4 Hz， 4H）， 3.00-2.95 （m， 1H）， 2.92-2.78 （m， 4H）， 2.21-2.13 （m， 2H）， 1.90 （s， 3H）， 1.65-1.56 （m， 4H）， 1.42-1.35 （m， 4H）， 1.28 （d， J = 6.9 Hz， 3H）， 0.97 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C31H45N5O3[M+H]+536.3611， found 536.3618。

2.2.7 ?（R）-4-[4-（2-乙酰氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（11g） ?灰白色固體，收率：75.5%，m.p.148.0～149.0 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.66 （s， 1H）， 8.19 （s， 1H）， 7.69 （d， J = 8.0 Hz， 2H）， 7.63 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 4.43 （t， J = 4.9 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H），3.48 （t， J = 6.8 Hz， 2H），3.38 （d， J = 6.8 Hz， 2H）， 3.25 （t， J = 8.3 Hz， 4H）， 3.05-3.01 （m， 1H）， 2.40-2.36 （m， 2H），1.92 （s， 3H）， 1.81-1.74（m， 4H）， 1.49-1.44（m， 4H），1.30 （d， J = 7.0 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C31H45N5O3 [M+H]+536.3614， found 536.3615。

2.2.8 ?4-[4-（1-乙酰氨基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（11h） ?灰白色固體，收率： 60.0%，m.p.165.4～167.7 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.37 （s， 1H）， 7.79 （s， 1H）， 7.67 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.37 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.17 （s， 1H）， 5.04-5.01 （m， 1H）， 4.30 （t， J = 5.6 Hz， 2H）， 4.00 （s， 3H）， 3.15 （t， J = 15.5 Hz， 2H）， 2.93 （t， J = 6.9 Hz，4H）， 2.23-2.18 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.67-1.62 （m， 4H）， 1.47 （d， J = 7.0 Hz， 3H）， 1.42-1.38 （m， 4H）， 0.98 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C30H43N5O3[M+H]+ 522.3316， found 522.3323。

2.2.9 ?（R）-4-[4-（1-乙酰氨基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（11i） ?灰白色固體，收率：76.0%，m.p.155.4～157.9 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.36 （s， 1H）， 7.74 （s， 1H）， 7.66 （d， J = 8.3 Hz， 2H）， 7.36 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.15 （s， 1H）， 5.04-5.00 （m， 1H）， 4.24 （t， J = 5.7 Hz， 2H）， 3.99 （s， 3H）， 2.86 （t， J = 7.1 Hz， 2H）， 2.62 （t， J = 20.9， 13.1 Hz， 4H）， 2.08 （dd， J = 13.3， 6.9 Hz， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.55-1.50 （m， 4H）， 1.47 （d， J = 7.0 Hz， 3H）， 1.34 （dd， J = 14.9， 7.5 Hz， 4H）， 0.93 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） Calcd for C30H43N5O3[M+H]+522.3442， found 522.3448。

2.2.10 ?（S）-4-[4-（1-乙酰氨基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（11j） ?灰白色固體，收率：77.0%，m.p.158.4～160.9 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.66 （s， 1H）， 8.16 （s， 1H）， 7.70 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.43 （d， J = 8.5 Hz， 2H）， 7.26 （s， 1H）， 5.05-5.02 （m， 1H）， 4.42 （t， J = 4.8 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H）， 3.47 （t， J = 7.7 Hz， 2H）， 3.25 （t， J = 8.3 Hz， 4H）， 2.39-2.35 （m， 2H）， 1.99 （s， 3H）， 1.80-1.75 （m， 4H）， 1.49-1.45 （m， 7H）， 1.03 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C30H43N5O3[M+H]+522.3419， found 522.3426。

2.2.11 ?4-[4-（2-氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（12a） ?黃白色固體，收率：77.8%，m.p.120.5～123.1 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.67 （s， 1H），8.27 （s， 1H）， 7.78 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.44 （d， J = 8.6 Hz， 2H）， 7.29 （s， 1H）， 4.45 （t， J = 5.4 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H）， 3.48 （t， J = 7.7 Hz，2H）， 3.27-3.22 （m， 5H）， 3.21-3.17 （m， 2H）， 2.41-2.36 （m， 2H）， 1.83-1.69 （m， 6H）， 1.50-1.43 （m， 4H）， 1.40 （d， J = 6.5 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.3， 2.7 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C29H47N5O2[M+H]+494.3487， found 494.3496。

2.2.12 ?（R）-4-[4-（2-氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（12b） ?黃白色固體，收率：73.8%，m.p.121.4～122.9 ℃。1H NMR（600 MHz， MeOD） δ 8.67 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 7.79 （d， J = 8.3 Hz， 2H）， 7.45 （d， J = 7.9 Hz， 2H）， 7.30 （s， 1H）， 4.45 （t， J = 5.0 Hz， 2H）， 4.10 （s， 3H）， 3.47 （t， J = 7.6 Hz， 2H）， 3.27-3.22 （m， 5H）， 3.21-3.17 （m， 2H）， 2.41-2.36 （m， 2H）， 1.82-1.71 （m， 6H）， 1.48-1.45 （m， 4H）， 1.40 （d， J = 6.5 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.3 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C29H47N5O2[M+H]+494.3380， found 494.3376。

2.2.13 ?（S）-4-[4-（2-氨基-1-甲基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（12c） ?黃白色固體，收率：70.0%，m.p.119.9～120.1 ℃。1H NMR（600 MHz， MeOD） δ 8.68 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 7.79 （d， J = 8.1 Hz， 2H）， 7.50 （d， J = 18.7 Hz， 2H）， 7.29 （s， 1H）， 4.31 （t， J = 5.2 Hz， 2H）， 4.10 （s， 3H）， 3.51-3.45 （m， 4H）， 3.45-3.39 （m， 2H）， 3.26-3.24 （m， 5H）， 2.38-2.32 （m， 2H）， 1.80-1.75 （m， 6H）， 1.47-1.46 （m， 4H）， 1.40 （d， J = 6.5 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.2 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C29H47N5O2[M+H]+494.3473， found 494.3476。

2.2.14 ?4-[4-（1-氨基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（12d） ?黃白色固體，收率：66.7%，m.p.126.7～127.9 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.71 （s， 1H）， 8.29 （s， 1H）， 7.92 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.75-7.67 （m， 2H）， 7.60 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.32 （s， 1H）， 5.08-5.02 （m， 1H）， 4.46 （t， J = 5.3 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H）， 3.47 （t， J = 5.9 Hz， 2H）， 3.24 （t， J = 5.4 Hz， 4H）， 1.80-1.76 （m， 6H）， 1.69 （d， J = 6.9 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.3 Hz， 10H）。HRMS（ESI）Calcd for C28H41N5O2[M+H]+ 480.3230， found 480.3228。

2.2.15 ?（R）-4-[4-（1-氨基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（12e） ?黃白色固體，收率：72.8%，m.p.127.4～130.6 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ 8.71 （s， 1H）， 8.29 （s， 1H）， 7.92 （d， J = 8.5 Hz， 2H）， 7.73-7.66 （m， 2H）， 7.59 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.30 （s， 1H）， 5.08-5.01 （m， 1H）， 4.46 （t， J = 5.4 Hz， 2H）， 4.10 （s， 3H）， 3.48 （t，J = 7.9， 7.3 Hz， 2H）， 3.25 （t， J = 8.8， 7.9 Hz， 4H）， 1.80-1.76 （m， 6H）， 1.69 （d， J = 6.9 Hz， 3H）， 1.03 （t， J = 7.4 Hz， 10H）。HRMS（ESI）Calcd for C28H41N5O2[M+H]+480.3315， found 480.3301。

2.2.16 ?（S）-4-[4-（1-氨基乙基）苯氨基]-7-甲氧基-6-（3-（二丁胺基）丙氧基）喹唑啉（12f） ?黃白色固體，收率： 76.5%。m.p.127.8～129.5 ℃。1H NMR （600 MHz， MeOD） δ8.71 （s， 1H）， 8.29 （s， 1H）， 7.92 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.76-7.63 （m， 2H）， 7.60 （d， J = 8.3 Hz， 2H）， 7.31 （s， 1H）， 5.06-4.99 （m， 1H）， 4.46 （t， J = 5.1 Hz， 2H）， 4.10 （s， 3H）， 3.47 （t， J = 15.4， 8.0 Hz， 2H）， 3.24 （t， J = 6.6 Hz， 4H）， 1.85-1.72 （m， 6H）， 1.69 （d， J = 6.9 Hz， 3H）， 1.48-1.44 （m， 4H）， 1.03 （t， J = 7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI）Calcd for C28H41N5O2[M+H]+480.31 92， found 480.3199。

2.3 ?體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT比色法測(cè)定目標(biāo)化合物11a-11J及12a-12f對(duì)肺癌細(xì)胞A549和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的體外抗腫瘤活性，以O(shè)TS514和吉非替尼作為陽(yáng)性對(duì)照藥。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和 MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中（8×104個(gè)/mL），置溫度37 ℃，5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基。設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和藥物組，96孔板內(nèi)分別加入用0.2% DMSO稀釋的梯度濃度藥物（0.5、1、5、10、25、50 μmol/L） 100 μL，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h（A549細(xì)胞）和72 h（MDA-MB-231細(xì)胞）后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入MTT（0.5 mg/mL）100 μL置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，出現(xiàn)紫色結(jié)晶，棄去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值，通過Graphpad prism軟件計(jì)算化合物的IC50值。結(jié)果見表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用局部修飾、電子等排等新藥設(shè)計(jì)原理，將OTS514的母核噻吩并[2，3-c]喹啉酮環(huán)替換成喹唑啉環(huán)，對(duì)其骨架環(huán)的4-位和6-位上的取代基進(jìn)行了重新的結(jié)構(gòu)修飾，成功設(shè)計(jì)并合成16個(gè)目標(biāo)化合物，經(jīng)1H NMR、MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞都有不同程度的抑制作用，6-位取代基分別為3-六氫哌啶丙氧基、3-四氫吡咯丙氧基、3-二甲胺丙氧基、3-嗎啉丙氧基和3-二丁胺丙氧基，在五種取代基團(tuán)中以二丁基胺的效果最佳，可能是二丁基胺中的碳鏈與生物大分子觸碰機(jī)率變大使兩者之間的范德華力變大，也有疏水鍵的作用，使兩個(gè)非極性區(qū)域間結(jié)合更加牢固，抗腫瘤效果更佳。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在4位的手性側(cè)鏈對(duì)抗腫瘤活性影響不大，手性側(cè)鏈中的碳鏈的長(zhǎng)短對(duì)活性影響也不是很明顯;在化合物11的基礎(chǔ)上，將乙酰基脫去得到化合物12a-12f，發(fā)現(xiàn)暴露的氨基能增強(qiáng)化合物的抗腫瘤活性，實(shí)驗(yàn)證明了計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果，暴露的氨基能與TOPK的GLU-116氨基酸形成氫鍵，使化合物與TOPK結(jié)合更加牢固。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了化合物12a-12f的抗腫瘤活性與陽(yáng)性對(duì)照藥OTS514相當(dāng)，且OTS514抗腫瘤活性優(yōu)于吉非替尼。為進(jìn)一步探索含有喹唑啉藥效團(tuán)的TOPK抑制劑研究打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)、合成了一系列含喹唑啉的TOPK抑制劑，通過將噻吩并[2，3-c]喹諾酮環(huán)替換成喹唑啉環(huán)，保留對(duì)TOPK的抑制特點(diǎn)增加其成藥性，通過結(jié)構(gòu)修飾得到16個(gè)化合物，并通過1H NMR、MS對(duì)其結(jié)構(gòu)確證。通過體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物12a-12f具有與陽(yáng)性對(duì)照藥OTS514相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性，為開發(fā)新結(jié)構(gòu)的TOPK抑制劑提供了思路。

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