基于分子對接技術虛擬篩選天然產(chǎn)物抗MRSA活性成分＊

雷 蕾，楊 樂，亢 力，武紅莉，王 忠＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所 北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所 北京 100700）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphy lococcus aureus，MRSA）是多藥耐藥性感染的最常見原因之一，具有顯著的發(fā)病率和死亡率，已成為醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一。多數(shù)的MRSA 感染會引起菌血癥，心內(nèi)膜炎和肺炎等疾病，危及生命[1]。目前，MRSA 作為一種超級細菌，僅對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺等少數(shù)抗菌藥物敏感。然而，萬古霉素有較強的腎毒性[2]，限制了其在臨床的應用，而且耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（hVRSA）已在全球檢測。臨床研究表明，hVRSA 與MRSA 密切相關，在某些國家50%的臨床MRSA 檢測到hVRSA 表型[3]。因此，科學家一直在尋找新的方法來對抗MRSA抗生素耐藥性的影響。

MRSA 具有多重耐藥性，其產(chǎn)生機制是PBPs 改變的結果，高度耐藥性系由于原有的PBP2 與PBP3 之間產(chǎn)生一種新的PBP2′（即PBP2a），低、中度耐藥系由于PBPs 的產(chǎn)量增多或與甲氧西林等的親和力下降所致?？朔股啬退幮缘淖畛Ｒ姺椒?，除了聯(lián)合使用抗生素治療以外，就是開發(fā)新藥。已經(jīng)有很多從天然產(chǎn)物中開發(fā)出新藥的例子，例如，青蒿素的開發(fā)[4]和長春花堿的開發(fā)[5]。天然產(chǎn)物是人類的寶庫，經(jīng)過多年的實驗研究，許多天然產(chǎn)物的藥理作用被測定出來。本研究期望從已經(jīng)報道的具有抗菌和抑菌作用的天然產(chǎn)物中篩選出可能具有抗MRSA 的藥物。

分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設計的方法，主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法。近年來，分子對接方法已成為計算機輔助藥物研究領域的一項重要技術?，F(xiàn)在應用中的分子對接軟件涵蓋了剛性對接、半柔性對接、柔性對接等各種對接方法，在能量優(yōu)化方面則使用了人工神經(jīng)網(wǎng)絡、遺傳算法、模擬退火、禁忌搜索、局部搜索等各種方法。在這項研究中，本課題組使用分子對接的方法對859 種具有抗菌和抑菌作用的天然產(chǎn)物與常見MRSA 抑制靶標青霉素結合蛋白2a（PBP2a）進行了分子對接，以期能夠找到有潛力的候選物，給新藥開發(fā)人員以重要參考。

1 資料與方法

1.1 平臺和軟件

本研究所有工作均在Microsoft Windows 2007 操作系統(tǒng)中完成，采用Accelrys 公司的Discovery Studio 4.5（DS 4.5）軟件。參數(shù)設置除非特殊指明，均為默認值。本研究采用的是CDOCKER程序，基于CHARMm、soft-core potentials、optional grid representation 受體配體對接。它隨機搜索小分子構象，采用模擬退火算法進行優(yōu)化，從而對接結果更加準確。分子ADMET 計算采用DS 4.5完成。

1.2 受體的準備

PBP2a 的3D 結構（PDB ID：3ZG0,2.60 ?）從通過晶體學研究發(fā)現(xiàn)，PBP2a存在變構位點和活性位點，變構結合域距離dd -轉肽酶活性位點60 ?。當小分子抑制劑在變構位點時，活性位點的殘基構象發(fā)生變化，從而允許配體進入[6]。3ZG0 是蛋白與兩個分子的Ceftaroline（頭孢洛林）共結晶體，配體Ceftaroline（ID:1W8）位于變構位點，Ceftaroline 分子（ID:AI8）位于活性位點。目前，3ZG0 已經(jīng)用于抗MRSA 藥物的虛擬篩選[7-8]。

本研究通過Clean Protein 工具去水加氫，再加CHARMm 力場優(yōu)化，定義蛋白為受體，以其原配體位置為中心，選擇半徑0.50 nm 范圍的殘基為活性殘基，將其定義sphere球，此范圍內(nèi)的空腔為結合口袋，最后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 配體數(shù)據(jù)的組建

從TCMDB 數(shù)據(jù)庫[9]中檢索得到生物活性包括“抗菌”和“抑菌”的化合物共859 個。這些化合物是實驗已經(jīng)證明可以抗菌或者抑菌的，但是還未進行抗MRSA 研究。首先，將化合物的sdf 格式文件導入DS4.5中，Small Molecules-prepare ligand 進一步將配體產(chǎn)生三維結構，加氫，產(chǎn)生異構體等；其次，使用Linpiski 規(guī)則進行篩選；最后，使用Small Molecules-Minimize Ligands，加CHARMm 力場進行能量最小化，保存為分子對接的配體分子集。

1.4 對接方法可信性驗證

含有原配體的蛋白晶體復合結構，將原配體抽離，然后按設定的參數(shù)對接回其結合口袋，計算對接后最高打分的構象與原配體結構的均方根偏差值（RMSD），一般RMSD≤0.20 nm[10]則認為該對接方法可行，說明該套參數(shù)能較好地重現(xiàn)此配體與受體的結合模式。

1.5 配體分子與受體靶點對接參數(shù)

將上述配體和受體導入DS 4.5，調(diào)用CDOCKER對接模塊，參數(shù)均為默認值。

3ZG0 變構位點結合口袋的位置是x=9.965744，y=52.253615，z=23.244846，結 合 口 袋 的 半 徑 為11.520969。

3ZG0 活性位點結合口袋的位置是x=27.901615，y=29.847026，z=88.316846，結 合 口 袋 的 半 徑 為12.825363。

1.6 結果處理

對接完成后，以原配體的對接結合能（INTERACTION ENERGY)為參考，值低于原配體的說明與蛋白結合能低于原配體，予以保留，得到潛在有活性的化合物。

1.7 ADMET計算

候選藥物的ADMET 分析包括血腦屏障參數(shù)（Blood Brain Barrier，BBB）、人類腸道吸收（Human Intestinal Absorption，HIA）、藥物水溶性（Aqueous Solubility）、Cytochrome P450 2D6（CYP2D6）和血漿蛋白結合參數(shù)（Plasma Protein Binding，PPB）。血腦屏障阻礙大多數(shù)藥物進入大腦，使有效候選藥物的開發(fā)變得困難。最近的研究報道，98%的藥物在臨床試驗中失敗，正是由于不能通過血腦屏障或達到特定的靶標。CYP2D6 參與肝臟內(nèi)多種底物的代謝，藥物對其的抑制作用是藥物-藥物相互作用的主要表現(xiàn)。因此，CYP2D6 抑制實驗是藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程中監(jiān)管程序的一部分。血漿蛋白結合藥物分子可以影響藥物的效率，因為結合部分暫時被屏蔽，而只有未結合部分可以發(fā)揮藥理作用。

2 結果

2.1 可行性驗證結果

本研究計算RMSD 小于0.2 nm，說明對接方法、所選用的蛋白質(zhì)晶體結構和參數(shù)的設定是可行的。

2.2 變構部位分子對接

本研究將原配體Ceftaroline 對接回變構部位結合口袋得到結合能為-54.8853。完成對接后，能量低于其化合物有81 個，結合能最低的10 個化合物，見表1和圖1。

2.3 活性部位分子對接

本研究將原配體Ceftaroline 對接回活性部位結合口袋，得到結合能為-65.7609，能量低于其化合物有33個，結合能最低的10個分子，見表2和圖1。

2.4 候選藥物的ADMET分析

變構位點和活性位點均對接較好的化合物有24 個 化 合 物 ，ADMET_BBB_Level 在 low 包 括 low 以上的化合物有9 個。本研究進行了ADMET 分析，見 表 3 和 圖 2。 可 以 看 出 ，Abyssinone V 和Isogancaonin C 的血腦屏障滲透水平為中等，腦-血比在0.3:1 和1:1 之間，其余的都為低，說明腦-血比低于0.3:1。 Gancaonin C，Isogancaonin C 和 Rhamnazin 的水溶性為最佳。9 個化合物預測均無Cytochrome P450 2D6 毒性，同時都具有良好的人類腸道吸收率。Glycycoumarin 和Kuwanon A 血漿蛋白結合較好。

2.5 作用模式分析

為了研究突變體結構與活性化合物的結合親和力，進行了作用模式的分析。結果表明，在表3 中，除了 Glycycoumarin 和 Quercetin-3-methyl ether 外，其余分子在3ZG0 變構位點上都與146 位蛋白通過范德華力或者氫鍵結合，而在3ZG0 活性位點上，除了范德華力和氫鍵外，還通過鹽橋、ππ 相互作用等與周圍的蛋白質(zhì)殘基相結合。

3 討論

根據(jù)美國疾病控制和預防中心的報告[CDC,2007]在感染金黃色葡萄球菌的人群中，約1%的感染是由MRSA引起的。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對目前很多廣譜抗生素都表現(xiàn)出耐藥性[11-12]，對公眾構成嚴重威脅。本課題組研究的天然產(chǎn)物都是具有抗菌或者抑菌活性的，雖然其沒有進行過抗MRAR 研究，但是只要PBP2a 蛋白的變構位點被一個藥物分子占據(jù)，蛋白活性位點就會被打開，這些藥物分子就可能成為抗MRAR的抗生素。

本研究通過分子對接研究，發(fā)現(xiàn)有Dihydrocalodenin B、Calodenin B、Piperaduncin C 等 24個化合物在變構位點和活性位點都有較低的結合能，預示著這24 個化合物可以先有一個分子與變構位點結合，觸發(fā)PBP2a 構象變化，使蛋白的活性部位可以與另一個分子結合，從而達到抗MRAR 的作用。實際上，PBP2a表現(xiàn)出耐藥性，是因為在PBP2a的變構位點（146位和150位）上發(fā)生了兩個氨基酸的變化，這兩個氨基酸的變化對頭孢類藥物產(chǎn)生了抗藥性，導致了頭孢類藥物耐藥MRSA 菌株的增加。本研究發(fā)現(xiàn)24 個化合物中有16 個與146 位通過非共價鍵相結合，例如，表1 和表2 中結合能都比較低的Dihydrocalodenin B、Calodenin B、Piperaduncin C 三個化合物在 3ZG0 變構位點上都與146位蛋白通過范德華力或者氫鍵結合，使其進入活性位點。本課題的研究結果將有助于設計出對耐藥MRSA 菌株具有潛在治療作用的有效化合物。

不良的ADMET 特性對有效藥物開發(fā)的失敗率有顯著影響。由于ADMET 的研究在有效抗生素的開發(fā)中起著至關重要的作用，因此本研究也分析了所選化合物的理化性質(zhì)。 結果發(fā)現(xiàn)Abyssinone V、Glycycoumarin 等9 個化合物表現(xiàn)出良好的ADMET 特性。值得注意的是，Isogancaonin C 水溶性較好，并且血腦屏障滲透能力也比較好。

有趣的是，在9 個化合物中，Gancaonin C、Glycycoumarin、Lupiwighteone 來自同一個中藥甘草。現(xiàn)代研究表明，甘草的醇提取物在體外對金黃色葡萄球菌、結核桿菌、大腸桿菌、阿米巴原蟲及滴蟲均有抑制作用[13]。同樣地，Kuwanon A 來自中藥桑白皮，研究表明，桑白皮的煎劑對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、福氏痢疾桿菌有抑制作用[14]。Quercetin-3-methyl ether來自中藥青蒿，青蒿提取物對表皮葡萄球菌、卡他球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌有較強的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、結核桿菌等也有一定的抑制作用[15]。Gancaonin C[16]、Glycycoumarin[17]、Lupiwighteone[18]、 Kuwanon A[19]、 Quercetin-3-methyl ether[20]均有較強的抗菌作用，值得進一步研究。

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圖1 表1和表2中化學成分的結構

表3 具有良好ADMET特性的9個化合物

圖2 表3中化學成分的結構