α7煙堿型受體的激動劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑改善精神分裂癥大鼠的社會缺陷及機制研究

甘全喜，李曉勇，范銀燕

膽堿能和多巴胺能系統(tǒng)之間失衡是精神分裂癥病理生理學(xué)假說之一[1,2]。研究表明，煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）（尤其是α7亞型）功能障礙與精神分裂癥感覺運動缺陷相關(guān)[1]。α7 nAChR激動劑（如A-582941）不僅可改善精神分裂癥認(rèn)知缺陷，還可逆轉(zhuǎn)γ-氨基丁酸能缺陷，如降低大鼠腦組織中小清蛋白和谷氨酸脫羧酶的表達[3,4]。增強腦組織中α7 nAChR的功能可能是治療精神分裂癥的潛在方案。但α7 nAChR激動劑常在低劑量時療效低，在高劑量時迅速脫敏，存在“倒U”型的量效曲線[4]，而α7 nAChR的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以克服激動劑快速脫敏這一不利條件[5]。正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與受體結(jié)合時不會誘導(dǎo)下一步反應(yīng)，但會增強α7 nAChR天然和外源激動劑的作用[6]。α7 nAChR激動劑通過正構(gòu)結(jié)合位點介導(dǎo)其作用，而正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑通過受體的變構(gòu)結(jié)合位點介導(dǎo)其作用[7]。但α7 nAChR的激動劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對精神分裂癥社會行為缺陷的影響的神經(jīng)生物學(xué)機制還尚未徹底闡明。因此，本研究建立慢性精神分裂癥大鼠模型，探討α7 nAChR激動劑、Ⅰ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑、Ⅱ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和非典型抗精神病藥物對大鼠社會行為的影響及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

雄性SD大鼠48只購自湖北省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，8～12周齡，體質(zhì)量180～250 g，標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)。MK-801購自美國Sigma公司；α7 nAChR激動劑A-582941購自美國Adooq公司；CCMI（Ⅰ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑）、PNU-120596（Ⅱ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑）、氯氮平（非典型抗精神病藥物）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自美國MedChemExpress公司。BCA蛋白定量試劑盒、ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。兔抗鼠α7 nAChR、磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4A和PDE4D一抗購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 所有大鼠隨機分為：對照組，模型組（MK-801+DMSO），激動劑組（MK-801+A-582941），Ⅰ型變構(gòu)組（MK-801+CCMI），Ⅱ型變構(gòu) 組（MK-801+PNU-120596），藥 物 治 療 組（MK-801+氯氮平）；每組8只。后5組大鼠腹腔注射MK-801（0.2 mg/kg），2次/d（8∶00和20∶00），連續(xù)7 d[8]；對照組在同一時間點注射相同體積的生理鹽水。7 d洗脫期后，對照組和模型組腹腔注射等體積10%DMSO，激動劑組腹腔注射1 mg/kg A-582941，Ⅰ型變構(gòu)組腹腔注射1 mg/kg CCMI，Ⅱ型變構(gòu)組腹腔注射3 mg/kg PNU-120596，藥物治療組腹腔注射5 mg/kg氯氮平；1次/d，連續(xù)10 d。

1.2.2 社會行為測試 在黑色有機玻璃盒（50 cm×50 cm×30 cm）、半光條件下進行。第1天為適應(yīng)期，第2天為測試期。測試方法：將待測鼠A和不熟悉的健康鼠B放到同一個小室中，自由度過10 min，記錄每只待測鼠的跟隨、回避和嗅探行為的時間。每只大鼠的總交互作用：跟隨行為時間+嗅探行為時間-回避行為時間。由2位實驗者根據(jù)視頻記錄進行評分，持續(xù)3 d，取2者3次的平均分為最后的數(shù)據(jù)。

1.2.3 指標(biāo)檢測 社會行為測試結(jié)束后，麻醉處死大鼠取腦，在冰上分離前額葉皮質(zhì)和海馬組織。ELISA試劑盒檢測各組前額葉皮質(zhì)和海馬組織中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平。采用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中的總蛋白，取20μg定量后的總蛋白，SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，3%BSA封閉45 min；加入α7 nAChR、PDE4A和PDE4D一抗（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗3次，加入二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗3次；化學(xué)發(fā)光。Image J軟件統(tǒng)計處理條帶，GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠社會行為比較

與對照組比較，模型組跟隨行為和總交互作用時間顯著降低（P＜0.05），回避行為時間顯著增加（P＜0.05）；Ⅰ型變構(gòu)組總交互作用時間顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動劑組跟隨行為和總交互作用時間顯著增加（P＜0.05），回避行為時間顯著降低（P＜0.05）；Ⅰ型變構(gòu)組、Ⅱ型變構(gòu)組和藥物治療組的回避行為時間顯著降低（P＜0.05），而跟隨行為和總交互作用時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組間嗅探行為時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠社會行為比較（s,±s）

表1 各組大鼠社會行為比較（s,±s）

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

組別對照組模型組激動劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8跟隨行為4.52±0.23 2.01±0.16①5.49±0.21②1.97±0.11 3.05±0.18 3.40±0.15回避行為1.34±0.05 3.21±0.09①1.75±0.06②0.87±0.05②1.68±0.10②1.22±0.08②嗅探行為28.39±3.71 21.43±5.25 32.50±6.18 18.62±4.02 27.95±4.68 25.33±5.01總交互作用31.57±4.56 21.21±3.19①36.26±5.36②19.70±3.57①29.31±3.03 27.53±3.41

2.2 各組大鼠α7 nAChR蛋白表達比較

與對照組比較，模型組前額葉皮質(zhì)和海馬組織中α7 nAChR蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動劑組、Ⅰ型變構(gòu)組、Ⅱ型變構(gòu)組和藥物治療組前額葉皮質(zhì)和海馬組織中α7 nAChR蛋白表達量顯著增加（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠α7 nAChR蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠α7 nAChR蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

組別對照組模型組激動劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8前額葉皮質(zhì)1.58±0.27 0.72±0.14①1.16±0.19②1.67±0.23②1.59±0.20②1.19±0.12②海馬0.52±0.09 0.23±0.04①0.47±0.10②0.59±0.06②0.50±0.08②0.40±0.09②

2.3 各組大鼠cAMP水平比較

與對照組比較，模型組前額葉皮質(zhì)cAMP水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動劑組、Ⅰ型變構(gòu)組、Ⅱ型變構(gòu)組和藥物治療組前額葉皮質(zhì)cAMP水平顯著增加（P＜0.05）；各組間大鼠海馬組織中cAMP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠cAMP水平比較（pmol/mL,±s）

表3 各組大鼠cAMP水平比較（pmol/mL,±s）

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

分組對照組模型組激動劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8前額葉皮質(zhì)13.06±2.49 7.43±1.51①12.95±2.07②13.40±2.13②12.71±2.84②12.88±1.97②海馬13.81±3.05 13.89±2.64 13.28±3.19 12.67±2.50 12.53±2.72 12.29±2.38

2.4 各組大鼠PDE4A和PDE4D蛋白表達比較

與對照組比較，模型組前額葉皮質(zhì)中PDE4A和PDE4D蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）；Ⅰ型變構(gòu)組額葉皮質(zhì)和海馬中的PDE4A顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動劑組、Ⅰ型變構(gòu)組和藥物治療組前額葉皮質(zhì)中PDE4A和PDE4D蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），Ⅱ型變構(gòu)組前額葉皮質(zhì)僅PDE4D蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。其余各組間海馬組織中PDE4A和PDE4D蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠PDE4A和PDE4D蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠PDE4A和PDE4D蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

分組對照組模型組激動劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8前額葉皮質(zhì)PDE4A 0.38±0.08 0.96±0.13①0.51±0.11②0.16±0.04①②0.20±0.06 0.29±0.06②PDE4D 0.40±0.14 0.89±0.20①0.42±0.12②0.25±0.09②0.36±0.10②0.57±0.13②海馬PDE4A 0.31±0.12 0.29±0.08 0.27±0.07 0.11±0.05①②0.27±0.11 0.36±0.15 PDE4D 0.27±0.10 0.35±0.14 0.29±0.09 0.23±0.06 0.26±0.05 0.28±0.08

3 討論

精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神疾病，其癥狀主要分為3類：陽性（妄想等）、陰性（缺乏社交和動機等）和認(rèn)知（學(xué)習(xí)和注意缺陷）癥狀。目前主要采用的典型和非典型抗精神病藥物治療精神分裂癥[9]。但研究發(fā)現(xiàn)，非典型藥物在治療陰性和認(rèn)知癥狀方面效果不如典型抗精神病藥物[10]，患者還可能出現(xiàn)粒細胞缺乏癥和代謝綜合癥等副作用。而長期使用典型抗精神病藥也會導(dǎo)致嚴(yán)重的錐體外系副作用。因此，探尋治療精神分裂癥的新方法及新藥物對治療極具價值。

精神分裂癥的病理生理學(xué)假說中被廣泛接受的是谷氨酸能亢進假說。皮質(zhì)腦干途徑中的谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）功能降低會導(dǎo)致精神分裂癥癥狀[9]。NMDAR拮抗劑（如MK-801）可導(dǎo)致嚙齒動物的精神分裂癥樣行為和神經(jīng)生物學(xué)變化[11]。本研究采用MK-801建立慢性精神分裂癥大鼠模型，結(jié)果顯示，MK-801可有效降低大鼠的跟隨行為和總交互作用，增加大鼠的回避行為，大鼠出現(xiàn)社會交互行為缺陷，即神經(jīng)分裂癥樣行為缺陷。

α7 nAChR功能障礙與精神分裂癥行為缺陷密切相關(guān)[1,2]。α7 nAChR激動劑是治療精神分裂癥的新穎且有前途的藥物[12]，但臨床療效仍不確定。另一種改善α7 nAChR功能的方法是其正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，其似乎也是治療精神分裂癥的有潛力的新方法。本研究表明，激動劑在改善精神分裂癥大鼠社交行為缺陷方面比正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑更有優(yōu)勢。這種差異不是很容易解釋，已知激動劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的主要區(qū)別之一是單獨的激動劑可以在受體上產(chǎn)生應(yīng)答，而正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑僅可以增加激動劑的現(xiàn)有應(yīng)答[6,7]。另外，α7 nAChR激動劑可引起突觸前神經(jīng)元釋放內(nèi)源性乙酰膽堿[4]。盡管本研究尚未研究與社會行為相關(guān)的大腦組織中乙酰膽堿（nAChR天然激動劑）的水平，但我們的數(shù)據(jù)顯示，單獨使用正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑時，由于內(nèi)源性激動劑的缺乏，導(dǎo)致正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的療效受限，而外源性激動劑可能更好地彌補了內(nèi)源性激動劑數(shù)量減少的這種情況。

目前關(guān)于α7 nAChR激動劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)（如腦中的cAMP系統(tǒng)）功效的了解有限?；诖耍狙芯恐饕U明它們是否能夠克服MK-801對細胞內(nèi)主要運輸途徑（包括cAMP及其上游調(diào)節(jié)劑PDE4A和PDE4D途徑）的損傷作用。研究表明，PNU-120596可增加參與學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的磷酸化[16]。本研究結(jié)果顯示，MK801可顯著增加前額葉皮質(zhì)中PDE4A和PDE4D的表達，這被α7nAChR激動劑、正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和氯氮平所逆轉(zhuǎn)。但是，這些影響在海馬中并未出現(xiàn)（除了CCMI）。MK-801也可顯著降低前額葉皮質(zhì)中cAMP水平，而在海馬中則沒有變化。此外，MK-801誘導(dǎo)海馬和前額葉皮質(zhì)中α7 nAChR蛋白表達下調(diào)，而α7nAChR激動劑、正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和氯氮平均可逆轉(zhuǎn)增加海馬和前額葉皮質(zhì)中α7 nAChR的蛋白表達。報道已表明，α7 nAChR激動劑而非正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)細胞中的受體表達上調(diào)[17]。原因可能為細胞對陰陽離子平衡的一種保護作用，α7 nAChR激動劑由于阻止了過多的正離子進入細胞而引起受體快速脫敏，但細胞可能需要招募更多新的受體來進行下一次生理刺激，因此導(dǎo)致α7 nAChR上調(diào)。而正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑不會引起受體上調(diào)，是因為它們在生理情況下不會使α7 nAChR脫敏[18]。已有研究顯示I型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑不抑制激動劑誘導(dǎo)的受體上調(diào)，因為其對脫敏動力學(xué)沒有影響；而II型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑抑制它，是因為其可使α 7 nAChR重新敏化并且不需要再上調(diào)受體表達[17]。在本研究中，腦中α7 nAChR表達的結(jié)果與先前報道不同。本研究中，MK-801給藥的大鼠，激動劑、正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和氯氮平均對α7 nAChR有上調(diào)作用，這可能是它們對MK-801誘導(dǎo)的腦損傷的逆轉(zhuǎn)作用。

本研究還有不足之處，I型與II型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑是否在體內(nèi)的功效、安全性和耐受性等方面有差異，正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑在體內(nèi)是否還具有其他優(yōu)勢，都需要進一步的實驗研究。但本研究結(jié)果提示α7 nAChR在精神分裂癥的細胞內(nèi)分子機制可能與cAMP/PDE4通路有一定的關(guān)系，值得繼續(xù)研究。

綜上所述，α7 nAChR激動劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對精神分裂癥樣的社會缺陷有一定的改善作用，其分子機制可能與PDE-4/cAMP通路有一定的關(guān)，確切的結(jié)論尚需進一步研究。