沈陽(yáng)地區(qū)50例聽(tīng)力損失兒童及其父母耳聾基因芯片篩查結(jié)果分析

王晶，惠蓮

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一院耳鼻喉科，沈陽(yáng) 110001）

研究［1］發(fā)現(xiàn)，耳聾不僅可以由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起，也可以由環(huán)境因素（如醫(yī)療、環(huán)境暴露、創(chuàng)傷和藥物等），或基因突變與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致。

KALATZIS等［2］和MORTON等［3］發(fā)現(xiàn)，遺傳性耳聾中有75%～80%為常染色體隱性遺傳，18%～20%為常染色體顯性遺傳，其余為X連鎖遺傳/線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）母系遺傳或染色體疾病。我國(guó)遺傳性耳聾患者涉及的主要是mtDNA、SLC26A4、GJB2和GJB3這4種基因的突變。其中，mtDNA基因突變主要包括1494M、1555M，SLC26A4基因突變主要包括IVS7-M、2168M，GJB2基因突變主要包括35M、176M、235M和299M，GJB3突變主要以538M為主。

基因檢測(cè)手段在新生兒先天性耳聾篩查中日益得到推廣［4］，基因篩查有助于確定高危人群，及早發(fā)現(xiàn)可能的晚發(fā)性聽(tīng)力損失，還可使患者及家庭成員獲得更有效的基因咨詢。本研究對(duì)沈陽(yáng)地區(qū)50例聽(tīng)力損失兒童及其父母進(jìn)行了耳聾基因檢測(cè)，旨在了解該地區(qū)先天性耳聾患者的致聾基因類型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：選擇2018年1月至3月在潮州凱普生物化學(xué)有限公司進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)的50個(gè)沈陽(yáng)地區(qū)家庭，包括50例患兒及其父母，共150例受檢者?；純耗挲g5個(gè)月～13歲，女19例，男31例。

1.1.2 試劑和儀器：耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）由潮州凱普生物化學(xué)有限公司提供。ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)生物應(yīng)用公司。

1.2 方法

抽取被檢者靜脈血2 mL于無(wú)菌抗凝管中（EDTA抗凝），立即低溫保存送檢。取100 μL血液樣本提取DNA，取2 μL作為模板。利用生物素標(biāo)記的引物對(duì)耳聾易感基因mtDNA、SLC26A4、GJB2和GJB3的突變部分進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后在導(dǎo)流雜交儀上將擴(kuò)增產(chǎn)物與不同突變類型耳聾易感基因探針雜交膜進(jìn)行導(dǎo)流雜交，通過(guò)化學(xué)顯色對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

2 結(jié)果

2.1 患兒的耳聾易感基因檢測(cè)情況

50例受檢患兒中，共檢出基因突變24例，陽(yáng)性率48%。其中，GJB2基因突變11例（22%），SLC26A4基因突變13例（26%）。見(jiàn)表1。

表1 沈陽(yáng)地區(qū)50例聽(tīng)力損失兒童基因檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The results of 50 hearing loss children gene tests in Shenyang

2.2 150例受檢者的基因篩查結(jié)果

如表2所示，50個(gè)家庭（150例受檢者）中，24個(gè)家庭（63例受檢者）篩查結(jié)果陽(yáng)性，其余26個(gè)家庭篩查結(jié)果陰性。63例篩查陽(yáng)性結(jié)果具體如下：GJB2基因235純合突變5例，235雜合突變20例，176雜合突變2例，299雜合突變1例；SLC26A4基因IVS7-2純合突變3例，IVS7-2雜合突變19例，2168雜合突變10例，1229雜合突變2例，IVS7-2、1229雜合突變1例。GJB3基因和mtDNA基因突變?cè)诒窘M受檢者中均為陰性。

3 討論

耳聾是單基因疾病，具有高度遺傳異質(zhì)性。研究［5］認(rèn)為，一半以上的先天性耳聾是由遺傳性因素導(dǎo)致，還有一半的先天性耳聾是由于患者本身的基因缺陷所致，或者是由于基因缺陷和基因多態(tài)性造成對(duì)致聾環(huán)境因素的易感性增加而致病。

GJB2基因定位于人13號(hào)染色體，全長(zhǎng)4 804 bp，有2個(gè)外顯子，其編碼區(qū)位為678 bp，編碼外顯子只有1個(gè)，編碼產(chǎn)物為縫隙連接蛋白26（connexin 26，Cx-26）。Cx-26是縫隙連接蛋白家族的一員，主要在耳蝸的血管紋、基底膜、螺旋緣、前庭間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)感覺(jué)上皮等處表達(dá)，在內(nèi)耳非感覺(jué)細(xì)胞中也有表達(dá)。王輝兵等［6］認(rèn)為，Cx-26蛋白是鉀離子回流到內(nèi)淋巴的通道，在維持耳蝸正常滲透壓及聽(tīng)覺(jué)機(jī)制中起著不可替代的重要作用。GJB2基因突變可致Cx-26異常，從而導(dǎo)致耳聾［7-10］。GJB2基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性耳聾的基因［11］，純合突變時(shí)發(fā)生耳聾，一般情況下，雜合突變不足以致聾，但也有文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道GJB2單雜合突變致聾。本研究中，純合及雜合突變均可致聾。

表2 150例受檢者的耳聾基因芯片篩查結(jié)果Tab.2 The results for 150 subjects deafness gene chip screening

SLC26A4基因編碼Pendrin蛋白，該蛋白有12個(gè)跨膜區(qū)域。Pendrin蛋白在內(nèi)耳的生理功能尚不明確，可能參與轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子進(jìn)出內(nèi)淋巴液，維持內(nèi)耳中內(nèi)淋巴液系統(tǒng)的正常離子平衡狀態(tài)［14］。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致大前庭水管綜合征和Pendred綜合征［15］。文獻(xiàn)［16］報(bào)道，耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果是SLC26A4雜合突變型的被檢者為遺傳性耳聾SLC26A4基因突變攜帶者。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，SLC26A4基因純合突變和雜合突變都可導(dǎo)致耳聾，應(yīng)建議被檢者親屬進(jìn)行基因檢測(cè)。

GJB2基因是最常見(jiàn)的致聾基因［17-19］。有文獻(xiàn)［20］報(bào)道，我國(guó)最常見(jiàn)致聾基因突變?yōu)镚JB2-235delC。第二位常見(jiàn)的耳聾突變基因是SLC26A4，臨床上與大前庭導(dǎo)水管綜合征直接相關(guān)［14］，中國(guó)前庭水管擴(kuò)大人群SLC26A4基因突變檢出率高達(dá)97%。攜帶SLC26A4基因突變的聾兒大部分是在外傷或感冒后出現(xiàn)聽(tīng)力下降，而且不可逆轉(zhuǎn)［21］。但在本研究中，50例受檢兒童中，SLC26A4基因突變陽(yáng)性檢出率為26%，是最常見(jiàn)的基因突變，而GJB2基因突變陽(yáng)性檢出率22%，為第二位。

mtDNA基因突變與非綜合征性耳聾發(fā)生密切相關(guān)，突變主要發(fā)生于12SrRNA基因和tRNASer基因［22］，患者表現(xiàn)為對(duì)氨基糖苷類抗生素異常敏感。氨基糖苷類藥物先后進(jìn)入耳蝸和前庭，抗生素在這2個(gè)部位發(fā)生蓄積，之后氨基糖苷類抗生素與12Sr-RNA結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞的損傷、凋亡，進(jìn)而影響聽(tīng)力，因此12SrRNA基因上的某些突變是氨基糖苷類抗生素致聾的重要分子基礎(chǔ)。mtDNA 12SrRNA基因突變是細(xì)胞質(zhì)遺傳，屬母系遺傳。研究［23］表明，由于mtDNA 12SrRNA基因突變而導(dǎo)致的耳聾患者有正常的耳蝸聽(tīng)神經(jīng)，即使患者有重度的耳聾，也可以通過(guò)移植電子耳蝸恢復(fù)其聽(tīng)力。本研究中未檢出mtDNA 12SrRNA基因突變。

GJB3基因是由夏家輝院士1998年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)、定位并成功克隆的第一個(gè)耳聾基因［24］，該基因突變可致常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合征型耳聾。馬占忠等［25］在韶關(guān)地區(qū)1 242例新生兒耳聾基因篩查中僅發(fā)現(xiàn)2例GJB3基因突變，由此可見(jiàn)，GJB3基因突變發(fā)生率較低。

本研究對(duì)沈陽(yáng)地區(qū)50例耳聾患兒及其父母進(jìn)行常見(jiàn)耳聾基因篩查檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)耳聾患者的致病基因主要為GJB2和SLC26A4基因。其中GJB2耳聾基因235delC突變位點(diǎn)的檢出頻率最高，其次為176del16和299delAT，未檢測(cè)到35delG和155delTCTG突變；SLC26A4基因檢出頻率最高的突變位點(diǎn)為IVS7-2A＞G，其次為2168A＞G、1229C＞T；未檢測(cè)到mtDNA1494C＞T 和1555A＞G、7445A＞G、12201T＞G位點(diǎn)突變；未檢測(cè)到GJB3538C＞T位點(diǎn)突變。