苦丁茶不同提取物抗氧化活性比較及其GC-MS分析

朱科學(xué) 刀春麗 顧文亮 徐飛 譚樂和

摘? 要：利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），對苦丁茶超聲輔助不同有機溶劑（乙醇、乙酸乙酯、石油醚）提取物及超臨界CO2萃取物的體外抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除活性、超氧陰離子自由基清除活性和ABTS+自由基清除能力）進行比較分析。結(jié)果表明，苦丁茶不同提取物DPPH清除能力和超氧陰離子自由基清除活性依次為：超聲乙醇提取物>超臨界CO2萃取物>超聲乙酸乙酯提取物>超聲石油醚提取物，羥基自由基和ABTS+自由基清除能力依次為：超聲乙醇提取物>超聲乙酸乙酯提取物>超臨界CO2萃取物>超聲石油醚提取物。GC-MS結(jié)果顯示，苦丁茶不同提取物中主要有5類物質(zhì)，共有49種化學(xué)成分，7種共有成分。

關(guān)鍵詞：苦丁茶;提取物;超臨界CO2;體外抗氧化活性;氣相色譜-質(zhì)譜

中圖分類號：R284.1;Q946.91? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Antioxidant Activities and GC-MS Analysis of Ilex kudingcha C.J. Tseng Extracts by Different Extraction Methods

ZHU Kexue1，2， DAO Chunli1，3， GU Wenliang1， XU Fei1， TAN Lehe1，2*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 3. College of Tropical Crop Science， Yunnan Agricultural University， Puer， Yunnan 665000， China

Abstract： The present study was aimed to compare the effects of the extracts of Ilex kudingcha C.J. Tseng with different organic solvents （ethanol， ethyl acetate， petroleum ether） assisted by ultrasound and supercritical CO2 extraction against oxidation activities （DPPH·） scavenging activity， hydroxyl radical （·OH） elimination activity， superoxide anion free radical （O2·） scavenging activity and ABTS+· radical elimination ability）， and component analysis by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The DPPH· and O2· scavenging abilities were as follows： ultrasound-ethanol extract > supercritical CO2 extract > ultrasound-ethyl acetate > ultrasound-petroleum ether extract. The OH· and ABTS+· radical scavenging abilities were as follows： ultrasound-ethanol extract > ultrasound-ethyl acetate extract > supercritical CO2 extract > ultrasound-petroleum ether extract. GC-MS analysis showed that there were five main types of substances in the four different extraction methods， a total of 50 chemical components and seven common components.

Keywords： Ilex kudingcha C.J. Tseng; extracts; supercritical CO2; in vitro antioxidant activity; GC-MS

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.022

苦丁茶（Ilex kudingcha C.J. Tseng）又稱皋盧茶，是冬青科常綠喬木，在我國已有2000多年飲用歷史，為我國民間重要的“特色茶”、“代用茶”，是我國南方常飲茶葉之一[1]。我國長江流域以南地區(qū)已有31種被稱作苦丁茶的植物，市面上常見的苦丁茶主要為冬青科和木犀科[2]?？喽〔柚懈缓喾N生物活性組分，如多酚、黃酮、多糖、氨基酸、三萜和皂苷等，具有顯著的抗氧化、降血脂、抑菌等生理功效，近年來受到越來越多研究學(xué)者的關(guān)注[3]?？喽〔柚械亩喾优c黃酮類等活性物質(zhì)不僅能夠作為食品的抗氧化劑，還可在食物油中逐漸溶解，可輔助減緩人體衰老[4]?，F(xiàn)今，苦丁茶被應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)，成為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N天然植物飲料，長期飲用苦丁茶，具有良好的保健作用[5-6]。

苦丁茶組分提取方法常見有熱水浸提[7]、超臨界CO2流體萃取[8]和超聲波法提取[9]等。其中超聲波輔助提取主要利用超聲波使提取物發(fā)生連續(xù)混合搖勻，利于溶質(zhì)與溶液間相互作用，可減少提取時間和增加有效成分的提取率，提高原料的利用率;而超臨界CO2流體萃取具有溫度易控制、循環(huán)周期短等優(yōu)點。劉祖生等[11]利用高效液相色譜法鑒定苦丁茶中黃酮類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)苦丁茶樣品中含有楊梅苷、槲皮素和蘆丁3種成分，在苦丁茶冬青中其成分的含量占有較大的比率。此外，張倩茹等[12]通過利用水蒸氣蒸餾法對貴州4種產(chǎn)地（正安、新舟、綏陽、湄潭）的苦丁茶（女貞屬）揮發(fā)油進行提取，并結(jié)合GC-MS分離鑒定，得出在4種苦丁茶樣品所提取出揮發(fā)油因產(chǎn)地不同，苦丁茶揮發(fā)油所含有的化學(xué)組分也存在著較大的差異。熊波等[13]通過有機溶劑（乙醚）超聲提取并結(jié)合蒸餾提取其所含揮發(fā)油，利用GC-MS分析對海南冬青苦丁茶的嫩葉進行揮發(fā)成分研究，共鑒定出57個成分，主要成分為醇類、醛類、酮類、醚類等化合物?？梢姡喽〔杼崛∥锞哂休^強的抗氧化性，主要與其中含有的多酚、黃酮等物質(zhì)含量有關(guān)。

本研究以海南產(chǎn)苦丁茶冬青為研究對象，采用超聲輔助有機溶劑浸提及超臨界CO2萃取進行苦丁茶組分提取，評價不同提取物的體外抗氧化活性;采用GC-MS技術(shù)對不同提取物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行定性分析，研究結(jié)果可為苦丁茶活性組分高值化應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 苦丁茶冬青由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供。DPPH（純度≥98%）和鄰苯三酚（純度≥98%）購自美國Sigma公司;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、雙氧水均為分析純試劑，購自西隴化工股份有限公司;鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、抗壞血酸等均為國產(chǎn)分析純試劑;磷酸氫二鈉為廣州牌分析純;磷酸二氫鈉為分析純，購于廣東光華化學(xué)廠有限公司。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? SFE-2型超臨界CO2萃取儀，美國Applied Separations（ASI）公司;R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪實驗設(shè)備公司;SB-5200DT型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司;750T型多功能粉碎機，鉑歐五金廠;N-EVAP12型氮吹儀，美國Organomation公司;ME4002E型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;SPECORD 250PLUS型紫外/可見分光光度計，德國耶拿公司;7890A氣相色譜-質(zhì)譜，美國安捷倫公司。

1.2? 方法

1.2.1? 超聲輔助有機溶劑浸提? 稱取一定量苦丁茶粉置于螺口棕色玻璃瓶中，分別加入無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚，超聲時間30 min后常溫下避光浸泡12 h，過濾、收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至5～10 mL，氮吹干備用。

1.2.2? 超臨界CO2萃取? 稱取一定量苦丁茶粉末，紗布包裹置于萃取壺，設(shè)定溫度為70 ℃、壓力為35 MPa，萃取2 h收集萃取物。

1.2.3? DPPH自由基（DPPH·）清除活性? 參照朱科學(xué)等[14]方法并稍作修改：量取1.0 mL不同方法提取物溶液（1.0 mg/mL），滴入0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液3.0 mL，置于10 mL試管，混合均勻，并在室內(nèi)避光保存半小時，于517 nm處測定各管反應(yīng)液吸光度，重復(fù)3次。計算公式如下：

（1）

式中：Ai是不同方法提取物溶液的吸光度、Ac是用無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.2.4? 羥基自由基（·OH）清除活性? 參照Zhu等[15]方法并稍作修改：在樣品組、空白組和對照組中按順序加入配制好的1.0 mL磷酸鹽緩沖液，1.0 mL鄰菲羅啉，1.0 mL用不同方法提取物溶液（1.0 mg/mL），1.0 mL硫酸亞鐵和0.5 mL 0.01% H2O2，反應(yīng)混合物在恒溫條件下（37 ℃）水浴反應(yīng)1 h后，測其536 nm處各樣品反應(yīng)液的吸光度值。計算公式如下：

（2）

式中：A0是對照組的吸光度（用無水乙醇代替）、A1是空白組的吸光度（用無水乙醇代替樣品和H2O2）、A2是樣品的吸光度。

1.2.5? 超氧陰離子自由基（O2·）清除活性? 參照Thuong等[16]方法配制反應(yīng)體系，試管中加入4.5 mL緩沖溶液（Tris-HCl），置于25 ℃水浴鍋中水浴20 min，加0.4 mL苦丁茶不同提取物溶液（1.0 mg/mL）和0.08 mL鄰苯三酚溶液（需在25 ℃保溫），混合均勻，測其325 nm處的吸光度值，并每隔0.5 min記錄1次吸光度值，連續(xù)讀4 min。對照為空白，空白管中的鄰苯三酚溶液換為HCl（10 mmol/L），以空白做參比。計算公式如下：

（3）

（4）

式中：An是空白或樣品吸光度最后1次記錄值、A1是空白或樣品吸光度第1次記錄值、V1是空白管氧化速率、V2是樣品管氧化速率。

1.2.6? ABTS+自由基清除能力? 參照Sridhar等[17]方法配制反應(yīng)溶液，ABTS+工作液需用蒸餾水稀釋，并且在734 nm下測其吸光度值必須為0.70± 0.02。取0.25 mL苦丁茶不同提取物溶液（1.0 mg/mL）與4.75 mL ABTS+工作液混合均勻，置于10 mL試管中，放置6 min，測734 nm處吸光度值，陽性對照為抗壞血酸（Vc）。以無水乙醇做參比。計算公式如下：

（5）

式中：A0為空白對照吸光度值、Ai為樣品組吸光度值、Aj為樣品本底吸光度值。

1.2.7? 氣相色譜-質(zhì)譜? 分別稱取0.15 g提取物，加入2850 mL正己烷，溶解、搖勻，有機濾膜過濾，GC-MS進樣分析。色譜條件：色譜柱為石英毛細(xì)管柱DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 mm），苦丁茶色譜柱的程序升溫條件為60 ℃保持12 min，以6 ℃/min到260 ℃，保持30 min;載氣為He;分流比為1∶50;進樣溫度設(shè)為250 ℃;質(zhì)譜條件：掃描方式為EI源;離子源溫度設(shè)置為230 ℃;檢測器電壓為1.25 kV;掃描時間為0.5 s。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010、Origin 9.0、SPSS 20.0等軟件完成。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并采用Origin 9.0軟件繪圖。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05時表示差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? DPPH·清除能力

如圖1所示，不同提取方法制備的苦丁茶提取物DPPH·清除能力不同，且清除率差異顯著。其中，超聲輔助乙醇提取物清除能力最強，清除率達(dá)到98.12%，其次是超臨界CO2萃取物，清除率為23.53%，相比之下超聲輔助石油醚提取物的清除作用是最小的，清除率為1.43%。由實驗結(jié)果可知，苦丁茶不同提取物對DPPH·的清除作用排序為：超聲乙醇提取物>超臨界CO2萃取物>超聲乙酸乙酯提取物>超聲石油醚提取物。

2.2? ·OH清除能力

由圖2可知，苦丁茶不同提取物具有良好的·OH清除能力，但不同提取物間差異較大。其中，超聲輔助乙醇提取物清除能力最強，清除率達(dá)到66.91%，其次是超聲輔助乙酸乙酯提取物，清除率為61.48%，這2種苦丁茶提取物的·OH清除率無顯著差異;超聲輔助石油醚提取物的清除作用是最小的，清除率僅為26.86%，與其他3種不同提取物均呈現(xiàn)顯著差異;苦丁茶不同提取物對·OH的清除作用由強到弱依次為：超聲乙醇提取物>超聲乙酸乙酯提取物>超臨界CO2萃取物>超聲石油醚提取物。

2.3? O2·清除能力

以O(shè)2·清除率作為考察苦丁茶不同提取物抗氧化活性的指標(biāo)之一。圖3結(jié)果顯示，不同方法制備的苦丁茶提取物O2·清除能力具有顯著差異，超聲輔助乙醇提取物的清除率最高，達(dá)87.27%，超聲輔助乙酸乙酯和石油醚提取物的清除能力較低（兩者無顯著差異），分別為38.26%和35.72%。由結(jié)果可知，苦丁茶不同提取物對O2·的清除作用由強到弱依次為：超聲乙醇提取物>超臨界CO2萃取物>超聲乙酸乙酯提取物>超聲石油醚提取物。

2.4? ABTS+·清除能力

圖4表示苦丁茶不同提取物對ABTS+·清除能力，結(jié)果顯示，不同提取方法制備的苦丁茶提取物對ABTS+·清除能力具有顯著差異。其中，超聲輔助乙醇提取物的清除率最高，達(dá)97.48%，超聲輔助石油醚提取物清除能力最低，為5.82%，苦丁茶不同提取物對ABTS+·清除作用由強到弱依次為：超聲乙醇提取物>超聲乙酸乙酯提取物>超臨界CO2萃取物>超聲石油醚提取物。

2.5? 苦丁茶中的組分分析

GC-MS組分分析結(jié)果顯示（表1），苦丁茶不同提取物中含49種揮發(fā)性物質(zhì)，主要為烷烴類、酯類、烯烴類、酸類等5類物質(zhì)。超聲輔助乙酸乙酯提取物、超聲輔助石油醚提取物、超臨界CO2萃取物和超聲輔助乙醇提取物各鑒定出30、20、21和16種成分，7種共有成分，分別是：乙酸正十七烷基酯、2-溴十六烷酸、油酸、新植二烯、6，11-二甲基-2，6，10-十二碳三烯、聚酰胺樹脂、9，17-十八二烯醛。

3? 討論

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其單電子可被自由基清除劑配對，通過顏色的變淺程度與配對電子數(shù)成劑量關(guān)系評價自由基的清除情況，DPPH·清除能力常被國內(nèi)外用來測定是否含有抗氧化活性的方法[18]。Liu等[5]對苦丁茶冬青中多酚含量及其抗氧化活性進行分析，研究發(fā)現(xiàn)，不同溶劑提取的苦丁茶多酚組分均具有顯著抗氧化活性。Thuong等[16]分析苦丁茶乙酸乙酯提取組分對DPPH·清除的清除作用，結(jié)果顯示，提取組分具有良好的自由基清除能力。本研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶不同提取組分具有良好的DPPH·清除能力，且清除率相差較大，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致。

·OH屬于活性氧化物，能夠降解生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和多糖化合物，繼而誘發(fā)一系列有害效應(yīng)。朱科學(xué)等[19]報道，苦丁茶中石油醚萃取物主要是脂質(zhì)類物質(zhì)，乙酸乙酯萃取物主要為酚類和黃酮類。而乙醇提取組分主要有脂溶性多酚等物質(zhì)[20]，超臨界萃取技術(shù)提取的有效成分主要包括黃酮類化合物、糖苷類化合物、生物堿、萜類化合物、香豆素等物質(zhì)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶不同提取物具有較高的·OH清除率，推測其對·OH的清除作用與組分成分可能有潛在的關(guān)聯(lián)性。

O2·是生物體代謝中產(chǎn)生的一種重要的活性氧自由基，其引起的機體生命代謝過程中脂質(zhì)過氧化是機體衰老、心血管疾病及腫瘤發(fā)生的重要原因[22]。Nagai等[23]對馬尾（問荊L.）水提取物和醇提物的抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)水提物和醇提物均具有O2·清除活性，其中醇提物清除率為40%，水提物清除率為93%，表明其天然提取物可用于功效食品的研發(fā)應(yīng)用。Li等[24]對超臨界CO2萃取蓮子心油的體外抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)蓮子心油可清除自由基，70 mg/mL劑量時清除率為25%。本研究結(jié)果與報道相一致：不同方法制備的苦丁茶提取物具有明顯的O2·清除能力。

ABTS+自由基脫色試驗是一種廣泛用于評價生物樣品抗氧化活性的方法。張文芹等[25]比較，大葉冬青苦丁茶與苦丁茶冬青苦丁茶多酚與黃酮含量、自由基清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬青苦丁茶水提液和大葉冬青苦丁茶水提液均具有ABTS+清除作用，冬青苦丁茶提取液的清除能力比大葉冬青苦丁茶提取液的稍強。呂雨晴等[26]以DPPH·清除能力、ABTS自由基清除能力、還原能力為抗氧化能力的評價指標(biāo)，比較超聲波提取法、微波輔助提取法、索氏提取法、回流提取法和浸漬提取法分別提取苦丁茶黃酮的抗氧化活性，結(jié)果表明，不同提取方法造成提取物中黃酮結(jié)構(gòu)破壞程度不同，抗氧化活性存在差異。本研究結(jié)果與現(xiàn)有報道相一致。

大量文獻(xiàn)報道表明，不同提取方法制備的苦丁茶提物的化學(xué)組分具有明顯差異。黃雙蓮[27]采用乙醇浸取法、乙醚浸取法、蒸餾萃取法和超聲波輔助蒸餾萃取法提取苦丁茶中香氣成分，并用GC-MS進行分析，結(jié)果表明：超聲輔助蒸餾萃取法提取苦丁茶香氣成分效果較好，GC-MS初步鑒定出19種香氣成分，主要為烯酮類、萜類、醇類、酯類、烯徑類與雜環(huán)化合物等。本研究對苦丁茶冬青4種不同提取物進行GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，樣品中主要有烷烴類、酯類、烯烴類、酸類與其他類5類物質(zhì)，主要以烷烴類和酯類為主，共有49種化學(xué)組分。

綜上所述，苦丁茶冬青作為海南省一張?zhí)禺a(chǎn)名片，其在抗氧化和抗衰老等功能產(chǎn)品研發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，本研究開展苦丁茶不同方法提取物抗氧化活性評價、風(fēng)味組成鑒定研究，實驗結(jié)果可為苦丁茶天然抗氧化劑等產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

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