云南2種野生苜蓿資源對酸鋁脅迫的響應分析

吳麗芳 魏曉梅 張麗芳 桂寶林

摘? 要：以云南2種野生苜蓿資源為材料，采用水培法研究酸鋁脅迫對幼苗生長的影響。通過分析酸、鋁單一及復合處理下幼苗根長、株高、生物量、根系活力、葉綠素和丙二醛含量、過氧化物酶和超氧化物岐化酶活性變化，比較2種苜蓿對酸、鋁的耐性。結果顯示：隨著酸度的增加，天藍苜蓿和紫花苜蓿幼苗的生長均受抑制，pH 7.0和pH 3.0處理對比分析，天藍苜蓿在根長、株高、生物量、根系活力增幅比紫花苜蓿的增幅小;鋁脅迫后，2種苜蓿在根長、株高、生物量、根系活力指標上均具有顯著差異，且隨著鋁濃度的增大，受抑制越嚴重;酸、鋁共同脅迫對2種苜蓿幼苗生長的影響大于單一脅迫對它的影響，pH 4.5，Al3+濃度300 mg/L時，2種苜蓿生長受抑最嚴重。酸、鋁單一脅迫及復合處理均顯著影響2種苜蓿，但天藍苜蓿對酸、鋁及酸鋁的耐性優(yōu)于紫花苜蓿。

關鍵詞：苜蓿;酸鋁脅迫;幼苗生長;抗氧化酶系

中圖分類號：S551+.7? ? ? 文獻標識碼：A

Analysis on Acid-aluminum Stress Response of Two Wild Alfalfa Resources in Yunnan

WU Lifang1， WEI Xiaomei1， ZHANG Lifang1， GUI Baolin2

1. College of Biological Resource and Food Engineering / Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan 655011， China; 2. Soil Fertilizer Workstation， Xundian County Agricultural Bureau， Xundian， Yunnan 650224， China

Abstract： Two wild alfalfa resources （Medicago lupulina， Medicago sativa） in Yunnan were used to study the effects of acid-aluminum stress on alfalfa seedling growth under water culture. The tolerance of the two alfalfa to acid and aluminum was compared by analyzing the changes of peroxidase and superoxide dismutase activities， root length， plant height， biomass， root vigor， chlorophyll content， malondialdehyde content under single and compound treatment of acid and aluminum. The seedling growth of the two alfalfas was inhibited significantly under acidity treatment. Comparation with pH 7.0 and pH 3.0， the root length， plant height， biomass and root activity of M. lupulina increased less than that of M. sativa. There were significant differences in the indexes for root length， plant height， biomass， root vigor between the two alfalfa resources under aluminum treatment. Seedling growth was seriously reduced with the increase of aluminum concentration. The influences of acidity and aluminum compound treatment on the seedling growth of the two alfalfa were greater than those of either stress in isolation. The growth of the two alfalfa was most severely inhibited under the pH 4.5， Al3+ 300 mg/L treatment. Under the conditions of acid， aluminum or acid-aluminum stress treatments， the tolerance of M. lupulina to acid， aluminum and acid-aluminum was better than that of M. sativa from the point of view of the indexes of growth or decline of seedling growth， physiological indicators， inhibition rate.

Keywords： alfalfa; acid-aluminum stress; seedling growth; antioxidant enzyme system

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.009

我國酸性土壤主要分布于南方15省、市、自治區(qū)，總面積約占全國土地面積的21%[1]，且隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的加快，農業(yè)上化學肥料的使用，酸性土壤面積日愈擴大，因此土壤酸化及酸性土壤對植物生長發(fā)育的影響早已成為一個研究焦點問題。鋁毒是酸性土壤上限制植物生長重要元素，常以不同的形式存在，其中離子態(tài)[Al3+、Al（OH）2+、Al（OH）2+]對植物的毒害最為嚴重。酸性土壤上鋁毒對植物的傷害首先表現(xiàn)于根部，其會破壞根尖結構，抑制根系生長[2-3]，進而影響植株地上部分生長，最終影響產量和品質。

苜蓿（Medicago sativa）是發(fā)展畜牧業(yè)不可或缺的豆科牧草之一，在我國已有上千年的栽培歷史，種植面積居世界第5位，約為世界的4.5%以上[4]。苜蓿喜中性或微堿性土壤（pH 6.7～7.5，pH<6.7，則土壤pH偏低），產量便會隨pH的下降而迅速降低[5]。我國南方地區(qū)土壤普遍偏酸性，致使苜蓿的種植受到極大限制，雖通過引種與培育新品種得到初步試驗推廣，但想要使苜蓿在南方地區(qū)持續(xù)長足發(fā)展，亟需解決苜蓿與酸性環(huán)境的適應問題。國內外對苜蓿耐酸鋁性從形態(tài)學、細胞學、生理生化代謝及分子水平上積累了許多研究成果，如Naras i m ha moorthy等[6]以二倍體苜蓿為材料，采用RFLP進行QTL分析，篩選出4個耐鋁性的標記。Naras i m ha moorthy等[7]研究認為二倍體苜蓿M. sativa ssp. Coerulea具有較高的耐鋁性，四倍體紫花苜?；螂s合性較高，對耐鋁性品種選育有一定困難。李智燕[7]比較天藍苜蓿與紫花苜蓿耐鋁性及及其根瘤菌生長的耐酸鋁性，認為天藍苜蓿的耐鋁性優(yōu)于紫花苜蓿，其根瘤菌也較之紫花苜蓿根瘤菌有較強的耐酸鋁性。楊丹娜等[8]研究單一酸、鋁及酸鋁共同脅迫對苜蓿種子發(fā)芽和幼苗生長的影響認為，共同脅迫的影響大于單一脅迫，pH<4.5、Al3+離子達50 mg/L以上時，苜蓿幼苗生長明顯受抑。邱曉等[9]采用水培試驗對27個紫花苜蓿品種的耐酸鋁性評價認為，基因型不同，其對酸鋁耐性不同，通過聚類分析得出巨人802、豐寶、WL525和薩蘭多為耐鋁性較好的品種。但不同研究者由于使用的材料不同，耐酸鋁性評價指標體系不同，難以再現(xiàn)其實驗結果，仍缺乏特異耐酸鋁強的優(yōu)質苜蓿資源。

云南分布有豐富的紫花苜蓿（M. sativa L.）、天藍苜蓿（Medicago lupulina L）、毛苜蓿（M. edgeworthii Sirj. Ex Hand. Mazz.）和南苜蓿（M. polymorpha L.）4種野生苜蓿資源[10-11]。野生資源對當?shù)貧夂蚣巴寥罈l件有相對強的適應能力，近年來，云南由于發(fā)展畜牧業(yè)的需要，急需大量生產豆科牧草，科技研究者對本地野生苜蓿開展了許多研究工作[12-19]，然而對苜蓿耐酸鋁性的研究積累仍欠缺。因此，本研究擬采用云南野生天藍苜蓿、德欽紫花苜蓿為材料，研究酸、鋁單一脅迫和復合脅迫下幼苗生長發(fā)育、生理代謝變化，以期能夠為南方酸性土壤下耐酸鋁苜蓿的選育提供理論依據，并為苜蓿在南方農業(yè)、畜牧業(yè)、草產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試天藍苜蓿（M. lupulina L.）采自于云南羅平板橋鎮(zhèn)，由羅平縣工信局區(qū)力松饋贈，德欽紫花苜蓿（Medicago sativa L.）采自于云南迪慶德欽縣金沙江干熱河谷區(qū)。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗設計? 挑選飽滿、無損害的苜蓿種子，用0.1%的HgCl2消毒8 min后，無菌水沖洗5次后放入育苗盤于玻璃溫室內進行育苗，待幼苗長出2片真葉后，每個苜蓿資源挑選長勢一致的植株，用脫脂棉為固定物固定于有孔泡沫板上，適應培養(yǎng)2 d后進行酸、鋁脅迫處理，每處理3次重復，Hoag land營養(yǎng)液+不同濃度酸、鋁培養(yǎng)，期間每3 d換1次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液以濕潤棉花即可，共培養(yǎng)10 d后測定各項指標。

酸脅迫：用1 mol/L HCl調節(jié)Hoagland營養(yǎng)液pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。

Al3+脅迫：用AlCl3為鋁源，Al3+濃度為0、50、100、200、300、400、500 mg/L。

酸鋁脅迫：pH 4.5對應Al3+濃度為0、50、100、200、300 mg/L。

1.2.2? 測量指標與方法? 根長、株高：分別測定脅迫前、后的株高和根長，計算相對根長和株高。相對抑制率=（對照?脅迫處理）/對照×100%。

生物量：從每個處理中隨機取出10株，電子天平上稱量幼苗的重量，計算單株均值。

根系活力采用TTC比色法測定[20]，葉綠素含量采用乙醇提取法[20]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[21]、過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[21]、超氧化物岐化酶（SOD）活性采用NBT法測定[21]。

1.3? 數(shù)據處理

利用Excel7.0、SPSS19.0軟件對數(shù)據進行整理與方差分析。

2? 結果與分析

2.1? 酸脅迫對2種苜蓿資源幼苗生長的影響

2種苜蓿資源幼苗生長對酸的脅迫響應見表1。從表1可知，天藍苜蓿和紫花苜蓿其幼苗根長、株高、生物量及根系活力隨pH的降低而降

低，各處理間均具有顯著性差異。pH 7.0時2種苜蓿各測定指標均獲得最大值，pH 3.0時各指標值最小，與pH 3.0對比，pH 7.0天藍苜蓿根長、株高、生物量、根系活力增幅分別為262.5%、225.0%、35.4%和165.3%，紫花苜蓿增幅分別為281.1%、316.0%、37.9%和187.3%。2種苜蓿相比較，pH 7.0時根長、株高、生物量其變化幅度不大;pH≤6.0，相同處理中，天藍苜蓿根長，株高和生物量均比紫花苜蓿要高;同一處理中根系活力天藍苜蓿均比紫花苜蓿強。其說明2種苜蓿對酸脅迫均表現(xiàn)敏感，紫花苜蓿對酸更加敏感。

2.2? 酸脅迫對2種苜蓿資源生理生化的影響

天藍苜蓿和紫花苜蓿幼苗葉綠素含量隨pH降低而下降，不同pH處理下均達到顯著性差異（表2）。天藍苜蓿幼苗中MDA含量隨pH的降低而上升，而pH 4.0時紫花苜蓿中MDA含量最高。MDA含量是植物膜系統(tǒng)對逆境的響應反映，含量越高，膜受損越大。POD活性隨pH降低而下降，SOD活性隨pH下降而上升，各處理均具顯著性差異。與pH 3.0處理相比，pH 7.0處理天藍苜蓿葉綠素含量增幅達113.2%，POD活性增幅為36.6%，MDA含量降幅為37.0%，SOD活性降幅為57.0%;而紫花苜蓿葉綠素含量增幅達141.9%，POD活性增幅為50.6%，MDA含量降幅為65.4%，SOD活性降幅為49.9%。

綜上所述，不同酸脅迫下，天藍苜蓿和紫花苜蓿幼苗生長及生理生化變化基本表現(xiàn)為：隨酸性增加其抑制作用越明顯。在所測定的8個指標中，中性（pH 7.0）與強酸（pH 3.0）相比，7個指標中天藍苜蓿的增幅或降幅比紫花苜蓿的測定值變化大，說明紫花苜蓿幼苗對強酸處理更為敏感。

2.3? 鋁脅迫對2種苜蓿資源幼苗生長的影響

不同濃度鋁脅迫對2種苜蓿幼苗生長的影響見表3。由表3可知，鋁脅迫均會抑制2種苜蓿的根長、株高、生物量及根系活力，受抑制程度隨鋁濃度的增加而增減，鋁離子為0～400 mg/L之間時，各處理間均具有顯著差異。與對照（Al3+為0 mg/L）相比，Al3+為500 mg/L天藍苜蓿根長、株高、生物量與根系活力4個指標上，其抑制率分別為72.5%、67.9%、71.2%和67.50%，紫花苜蓿其抑制率分別為77.1%、71.2%、71.9%和77.4%。比較而言，紫花苜蓿高鋁脅迫時，抑制率比天藍苜蓿要高。

2.4? 鋁脅迫對2種苜蓿資源幼苗生理生化的影響

不同濃度鋁脅迫對2種苜蓿幼苗生理生化的影響見表4。從表4可知，不同鋁濃度處理對2種苜蓿在葉綠素含量，MDA含量、POD及SOD活性均產生不同影響，其葉綠素含量和SOD活性隨鋁離子濃度的增加而下降，MDA含量和POD活性隨鋁離子濃度的增加而升高。其中，與對照相比，Al3+為500 mg/L處理天藍苜蓿葉綠素含量抑制率為74.6%，POD活性抑制率為31.8%，MDA含量增幅為79.4%，SOD活性增幅為61.1%;而紫花苜蓿葉綠素含量抑制率為80.2%，POD活性抑制率為30.9%，MDA含量增幅為43.3%，SOD活性增幅為55.6%。

綜上所述，不同鋁濃度處理時，天藍苜蓿和紫花苜蓿幼苗生長及生理生化變化基本表現(xiàn)為：隨鋁濃度增加其抑制作用越明顯。在高鋁脅迫下，8個測定指標中，紫花苜蓿根長、株高、生物量、根系活力、葉綠素含量的抑制率比天藍苜蓿高，丙二醛含量、SOD和POD活性表現(xiàn)相反趨勢。MDA含量、SOD和POD活性表現(xiàn)相反趨勢。

2.5? 酸鋁脅迫對2種苜蓿資源幼苗生長的影響

當pH為4.5時，不同濃度鋁脅迫對2種苜蓿幼苗生長的影響見表5。由表5可知，幼苗根長、株高、生物量及根系活力隨著鋁濃度的增加而降低，其天藍苜蓿抑制率分別為81.1%、78.2%、55.0%和64.2%。紫花苜蓿抑制率分別為84.7%、85.0%、61.4%和66.1%。從比較看出，高鋁脅迫時紫花苜蓿抑制率比天藍苜蓿要高，說明天藍苜蓿相較紫花苜蓿耐酸鋁脅迫。

2.6? 酸鋁脅迫對2種苜蓿資源幼苗生理生化的影響

當pH為4.5時，不同濃度鋁脅迫對2種苜蓿幼苗生理生化的影響見表6。由表6可知，酸鋁脅迫處理對2種苜蓿在葉綠素含量，MDA含量、POD及SOD活性均產生不同影響，其葉綠素含量隨鋁離子濃度的增加而下降，MDA含量隨鋁離子濃度的增加而升高，而POD和SOD活性在天藍苜蓿與紫花苜蓿之間變化有所不同，天藍苜蓿POD和SOD活性低酸鋁脅迫（Al3+ 50 mg/L）先增后降，紫花苜蓿POD活性隨鋁濃度的增加先增后降，SOD活性隨鋁濃度的增加而下降。與對照相比，Al3+ 300 mg/L處理天藍苜蓿葉綠素含量抑制率為77.3%，POD活性抑制率為31.7%，SOD抑制率為35.7%，MDA含量增幅為47.4%;而紫花苜蓿葉綠素含量抑制率為84.4%，POD活性抑制率為39.9%，SOD抑制率為47.8%，MDA含量增幅為48.1%。

3? 討論

酸鋁脅迫時，根系是最先作用的器官，根系感受逆境脅迫信號后，通過激發(fā)信號分子轉導后，調節(jié)自身抗氧化酶類及蛋白表達，調整自身生理代謝適應逆境，因此，根系對環(huán)境的適應能力能直觀反映對酸、鋁的耐受性，如果根系生長受抑，其相應的株高、產量等均會受到影響。本研究中，2種苜蓿資源在酸脅迫下幼苗生長均受到影響，但天藍苜蓿的生長優(yōu)于德欽紫花苜蓿，說明一定酸度處理下，天藍苜蓿對酸的耐受性優(yōu)于紫花苜蓿。2種苜蓿在測定的各指標中，根系長度、根系活力、株高、生物量、葉綠素含量、POD活性隨pH的降低而降低，pH 3.0時受抑最嚴重，pH 7.0生長最好。這一研究結果與楊丹娜等[8]、李劍峰等[22]對紫花苜蓿酸脅迫強酸嚴重抑制，而弱酸有促進發(fā)芽及幼苗生長的研究結論不一致。MDA含量在2種苜蓿之間稍有變化，天藍苜蓿中含量隨pH的降低而上升，而紫花苜蓿中pH 4.0時含量最高，這可能是由于紫花苜蓿對酸的耐受性為4.0時已到一定極限。

單一鋁脅迫下，根據實驗數(shù)據可知，不同濃度鋁脅迫下，天藍苜蓿和紫花苜蓿幼苗根長、株高、生物量及根系活力均受到不同抑制，不同處理間均有顯著差異。與對照相比，同一測定指標中，Al3+ 500 mg/L紫花苜蓿的抑制率高于天藍苜蓿，說明天藍苜蓿耐鋁能力高于紫花苜蓿。

酸鋁復合處理時，2種苜蓿幼苗根長、株高、生物量及根系活力隨著鋁濃度的增加而降低，與對照相比，天藍苜蓿抑制率分別為81.1%、78.2%、55.0%和64.2%。紫花苜蓿抑制率分別為84.7%、85.0%、61.4%和66.1%。天藍苜蓿葉綠素含量抑制率為77.3%，POD活性抑制率為31.7%，SOD抑制率為35.7%，MDA含量增幅為47.4%;而紫花苜蓿葉綠素含量抑制率為84.4%，POD活性抑制率為39.9%，SOD抑制率為47.8%，MDA含量增幅為48.1%。比較單一酸、單一鋁及酸鋁共同脅迫，不難發(fā)現(xiàn)單一酸處理對苜蓿形態(tài)指標的影響沒有單一鋁影響大，而酸鋁共脅迫其抑制作用最為明顯，其研究結論與楊丹娜等[8]的研究一致。有所差異的是楊丹娜等[8]研究認為pH低于6.0才會有毒害作用，而本研究中pH低于7.0均會產生抑制。逆境脅迫時，植物體內MDA含量變化反映了細胞膜受損程度，POD和SOD活性的高低呈現(xiàn)出抵抗逆境的程度[23]。本研究中，酸度越高，鋁濃度越高，MDA含量越高，POD活性越低，SOD活性隨著脅迫強度的增加均有明顯上升趨勢，從評價的8個指標分析，天藍苜蓿對酸鋁的耐受性比紫花苜蓿要強。

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