Musashi1基因調控結腸癌HCT116細胞惡性生物學行為的機制研究

高 超，田彥明，丁博月，張 翼

1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學生理教研室，河北 石家莊 050017

Musashi1（Msi1）屬于RNA結合蛋白家族的一員，是RNA轉錄后表達的關鍵調控者，通常在腸道、中樞神經系統(tǒng)祖細胞和干細胞上高表達，對于維持自我更新與分化之間的平衡具有重要作用，因此其功能或表達異常能夠以多種方式影響細胞的生理過程［1］。目前已在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Msi1高表達，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵調節(jié)因子［2-6］，但至今Msi1在結腸癌中的確切作用及機制仍不明確。最新研究表明，Msi1主要通過與靶基因mRNA 3’-非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）特異性地結合調控其下游基因表達，進而參與細胞增殖、細胞周期、細胞分化和細胞凋亡［7］。據報道p27 mRNA的3’-UTR區(qū)存在Msi1的潛在結合位點［8］。因此推測Msi1可能通過調節(jié)p27進而參與結腸癌的演進過程，本研究通過慢病毒沉默Msi1基因，明確Msi1對結腸癌HCT116細胞增殖、克隆形成能力及細胞周期的影響，并利用熒光素酶報告載體證實Msi1通過靶向調節(jié)p27發(fā)揮調控作用，闡明Msi1作用的分子機制，完善結腸癌中Msi1的信號通路，為結腸癌精準治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 慢病毒載體構建

由上海吉凱基因化學技術有限公司構建Msi1基因沉默重組慢病毒載體GV248-Msi1-shRNA和陰性對照慢病毒載體GV248-NCshRNA，共設計2條Msi1目標序列，最終選取干擾序列：5’-TGTTACATGGTGTTTCGAA-3’，同時設計一條陰性對照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組轉染

將購自美國ATCC公司的人結腸癌細胞HCT116用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液（美國Gibco公司）常規(guī)培養(yǎng)。每孔5×104個目的細胞接種于6孔板中，按病毒感染復數值為20，分別加入適量的陰性對照病毒載體和沉默Msi1病毒載體的病毒液，感染72 h后觀察熒光表達情況評估感染效率，通過嘌呤霉素（美國Sigma公司）加壓篩選構建穩(wěn)定表達的細胞系。實驗將結腸癌HCT116細胞系分為未做任何處理的空白組（Blank組）、轉染GV248-Msi1-shRNA的沉默組（Msi1-shRNA組）和轉染GV248-NC-shRNA的陰性對照組（NC組）

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測mRNA表達

利用TRIzol裂解液［寶生物工程（大連）有限公司］提取各組細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒（日本Takara公司）合成cDNA。由生工生物工程（上海）股份有限公司設計的Msi1、p27和GAPDH引物見表1。反應體系為20 μL：10 μL SYBR Premix、cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL及RNase-Free H2O 8 μL。采用7500型RTFQ-PCR（美國ABI公司）進行RTFQ-PCR實驗。mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt分析法。

表1 RTFQ-PCR引物列表Tab.1 Primer list of RTFQ-PCR

1.4 細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞增殖活性

取對數生長期的各組細胞，以4×103個/孔接種于96孔板中，設5個復孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，分別向每孔加入10 μL CCK-8溶液（日本Dojindo公司），37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度（D）值，細胞活性%=（D實驗組/D空白組）×100%。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取對數生長期的各組細胞，以1 000個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時則終止培養(yǎng)；每孔加入1 mL甲醇室溫下固定細胞20 min；然后每孔加入0.2%結晶紫染色液染色30 min。顯微鏡下計數多于50個細胞的克隆數。

1.6 流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞周期分布

取對數生長期的3組細胞，各組細胞培養(yǎng)48 h后收集細胞，加入70%的乙醇于4 ℃固定過夜；上機前每管加入2.5 μL的RNase A（美國BD公司）室溫溫育20 min，再加入25 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（美國BD公司），室溫避光保存15 min，用FACSAria Ⅱ FCM（美國BD公司）檢測，數據由Modfit軟件分析。

1.7 裸小鼠移植瘤實驗檢測體內成瘤能力

用注射器將各組細胞接種于BALB/c裸小鼠（中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，動物生產許可證號為SCXK京2009-0008）右上肢外側皮下（5×106個細胞/只），每周觀察裸小鼠的一般狀態(tài)及腫瘤形態(tài)，并記錄裸小鼠的移植瘤體積，V（cm3）＝長×寬2/2。于接種后第8周處死裸小鼠，剝離瘤塊后稱其質量，抑瘤率（%）＝［（對照組平均瘤質量-沉默組平均瘤質量）/對照組平均瘤質量］×100%。

1.8 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

按照蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）操作說明，分別提取各組細胞總蛋白。采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白質，隨后于恒壓100 V轉膜2 h，轉印后的PVDF膜使用5%的脫脂奶粉封閉2.5 h，加一抗（英國Abcam公司）、β-actin（英國Abcam公司），4 ℃冰箱過夜。之后加入對應辣根過氧化物酶標記二抗IgG（英國Abcam公司）；采用ECL檢測，GenoSens凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）分析條帶灰度值。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗

PubMed檢索顯示，p27 mRNA的3’-UTR區(qū)可能存在Msi1的潛在結合位［（G/A）UnAGU，n=1～3］［8］。用Primer 5軟件設計p27引物，詳見表2，擴增出p27的3’-UTR野生型（wild type，WT）和突變型（mutant，MU）片段，將p27 mRNA3’-UTR中Msi1的兩個結合位點由WT1（ATAGT）和WT2（GTAGT）突變?yōu)镸U1（CGCAG）和MU2（AGCAG），再把野生型（WT1和WT2）和突變型（MU1和MU2）分別克隆進入雙熒光素酶真核表達載體pMIR-Report（美國Ambion公司）中。檢測報告基因質粒與海腎質粒共轉染目的細胞，按照LipofectamineTM2000脂質體（美國Invitrogen公司）轉染說明操作。轉染48 h后加入熒光素酶檢測試劑，測定螢火蟲熒光素酶的活性，隨后加入Stop＆Glo試劑測定海腎熒光素酶的活性，相對熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性之比表示。

表2 p27引物列表Tab.2 Primer list of p27

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 慢病毒感染HCT116細胞

慢病毒感染人結腸癌HCT116細胞株72 h后，熒光顯微鏡觀察感染細胞綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達情況，100倍視野計數各組熒光細胞數（NC組：538.33±11.06，Msi1-shRNA組：553.33±15.04）和總細胞數（NC組：581.67±21.20，Msi1-shRNA組：597.33±28.02），熒光細胞占比即為感染效率，在熒光顯微鏡下觀察到細胞感染效率在90%以上（圖1A）。RTFQ-PCR結果顯示，慢病毒轉染后Blank組、NC組和Msi1-shRNA組mRNA相對表達量分別為1.079±0.099、1.002±0.078和0.262±0.053，慢病毒成功干擾Msi1-shRNA組細胞Msi1表達，相對于陰性對照組沉默效率為73.85%（P＜0.001，圖1B）。

圖1 慢病毒抑制Msi1表達水平Fig.1 Lentiviral-mediated RNAi suppressed expression of Msi1

2.2 沉默Msi1基因對HCT116細胞增殖活性的影響

慢病毒感染HCT116細胞后，采用CCK-8檢測各組細胞的生長情況，酶標儀檢測3組細胞24、48、72 h的450 nm處的D值，根據D值繪制細胞增殖曲線。結果顯示，Msi1-shRNA組細胞在各時間點的增殖速度均明顯低于Blank組及NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Msi1-shRNA組24、48、72 h細胞活性相對于Blank組分別為85.81%±2.26%、83.13%±2.03%、74.48%±3.08%，而Blank組與NC組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因表達后，結腸癌HCT116細胞的增殖能力明顯降低（圖2）。

圖2 CCK-8實驗檢測沉默Msi1基因后HCT116細胞生長曲線Fig.2 Growth curve of HCT116 cells after Msi1 gene silencing detected by CCK-8 assay

2.3 沉默Msi1基因對HCT116細胞克隆形成能力的影響

通過平板克隆實驗檢測慢病毒沉默HCT116細胞Msi1表達后對克隆形成能力的影響。3組細胞以1 000個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時則終止培養(yǎng)，顯微鏡下計數多于50個細胞的克隆數。結果顯示，Msi1-shRNA組細胞形成集落數（267.67±39.81）明顯低于Blank組（474.00±79.30）和NC組（457.33±53.58），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而Blank組與NC組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因表達能夠顯著降低結腸癌HCT116細胞克隆形成能力（圖3）。

2.4 沉默Msi1基因對HCT116細胞周期的影響

通過FCM檢測慢病毒沉默HCT116細胞Msi1表達后對細胞周期的影響。慢病毒感染HCT116細胞后，取對數生長期的3組細胞培養(yǎng)48 h后收集，加入70%的乙醇于4 ℃固定過夜，使用FCM PI染色法上機檢測各組細胞周期變化，結果顯示，與Blank組（42.67±3.37）和NC組（44.20±4.60）相比較，Msi1-shRNA組G0/G1期細胞百分比（54.83%±4.09%）顯著增加（P＜0.05）；Msi1-shRNA組S期細胞百分比（8.14%±1.81%）與Blank組（13.13%±1.45%）、NC組（13.70%±2.13%）相比明顯減少（P＜0.05）；而Msi1-shRNA組、Blank組和NC組的G2/M期細胞百分比分別為37.03%±5.28%、44.17%±4.35%和42.03%±2.61%，Msi1-shRNA組G2/M期細胞有減少趨勢（P＞0.05），Blank組與NC組之間差異無統(tǒng)計學意義，提示沉默Msi1基因使結腸癌HCT116細胞周期阻滯于G0/G1期，S期細胞明顯減少，細胞分裂顯著減緩（圖4）。

圖3 克隆形成實驗檢測沉默Msi1基因對HCT116細胞克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of Msi1 gene silencing on colony forming ability of HCT116 cells detected by clone formation assay

圖4 FCM檢測沉默Msi1基因對HCT116細胞周期的影響Fig.4 Effect of Msi1 gene silencing on cell cycle of HCT116 cells detected by FCM

2.5 沉默Msi1基因對HCT116細胞裸小鼠移植瘤的影響

通過裸小鼠移植瘤實驗檢測慢病毒沉默Msi1基因對HCT116細胞體內成瘤性的影響。用注射器將3組細胞分別接種于BALB/c裸小鼠右上肢外側皮下，每周觀察裸小鼠的的移植瘤體積，V（cm3）＝長×寬2/2。于接種后第8周處死裸小鼠，剝離瘤塊后稱重。根據測量得到的移植瘤體積繪制其生長曲線。與Blank組和NC組相比，Msi1-shRNA組成瘤時間較晚且生長緩慢（P＜0.05，圖5），并且Msi1-shRNA組腫瘤質量［（0.39±0.14）g］明顯小于Blank組［（0.93±0.23）g］及NC組［（0.84±0.18）g］（P＜0.01），抑瘤率為58.06%，Blank組及NC組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因可顯著抑制結腸癌HCT116細胞在體內的生長（圖6）。

圖5 沉默Msi1基因對HCT116細胞移植瘤生長的影響Fig.5 Effect of Msi1 gene silencing on xenograft tumor growth of HCT116 cells

圖6 沉默Msi1基因對HCT116細胞移植瘤重量的影響Fig.6 Effect of Msi1 gene silencing on xenograft tumor weight of HCT116 cells

2.6 沉默Msi1基因對HCT116細胞p27 mRNA表達的影響

采用RTFQ-PCR檢測慢病毒沉默HCT116細胞Msi1基因后對p27mRNA表達的影響，mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt分析法。結果顯示，Blank組、NC組與Msi1-shRNA組p27 mRNA表達量分別為0.992±0.111、1.006±0.142和0.968±0.121，3組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示沉默Msi1基因并不影響p27 mRNA表達（圖7）。

2.7 沉默Msi1對HCT116細胞p27蛋白水平的影響

采用Western blot檢測慢病毒沉默HCT116細胞Msi1后對p27蛋白水平的影響。Msi1-shRNA組p27蛋白相對水平（0.602±0.105）明顯高于Blank組（0.187±0.049）及NC組（0.228±0.072）（P＜0.01），而Blank組及NC組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示降低Msi1表達可以上調p27蛋白水平（圖8）。

圖7 RTFQ-PCR檢測各組細胞p27 mRNA相對表達水平Fig.7 The p27 mRNA expression of each group detected by RTFQ-PCR

圖8 Western blot檢測各組細胞p27蛋白相對水平Fig.8 The p27 protein level of each group detected by Western blot

2.8 Msi1通過p27 mRNA的特定位點抑制p27表達

Msi1主要通過與下游靶基因mRNA 3’-UTR特定序列結合而調控下游靶基因的表達。實驗中將靶基因p27 mRNA 3’-UTR區(qū)的野生型（WT1和WT2）和突變型（MU1和MU2）結合序列克隆至載體中報告基因熒光素酶的下游，構建熒光素酶質粒，并送至上海吉凱基因化學技術有限公司進行測序分析，證實已將p27 mRNA 3’-UTR區(qū)的野生型和突變型結合序列克隆入pMIRReport載體（圖9）。Msi1可通過該結合序列調控熒光素酶的表達，檢測熒光素酶的活性變化可以鑒定Msi1對p27是否有調控作用。將構建的p27 3’-UTR區(qū)的熒光素酶報告載體（p27野生型）及其突變體（p27突變型），分別轉染3組細胞。結果顯示，與Blank組（0.373±0.045）、NC組（0.438±0.072）相比，Msi1-shRNA組（0.954±0.075）p27野生型的熒光素酶活性明顯上升（P＜0.001），提示Blank組和NC組中高表達的Msi1可以和野生型p27 mRNA 3’-UTR特定序列結合并抑制熒光素酶的表達，而沉默組Msi1低表達，因此熒光素酶的表達上調。同時，各組Msi1反應位點突變體p27突變型的熒光素酶活性則沒有明顯變化（P＞0.05），表明Msi1是通過與p27 mRNA 3’-UTR區(qū)結合從而抑制了p27蛋白表達（圖10）。

圖9 2種質粒測序圖Fig.9 Sequencing map of 2 plasmids

圖10 Msi1通過結合p27 mRNA的特定位點抑制p27蛋白表達Fig.10 Msi1 inhibited p27 protein expression by binding to specific sites of p27 mRNA

3 討 論

Msi1是一種進化保守的RNA結合蛋白，它的作用與轉錄因子類似，是干細胞的重要標志物，但在分化后的細胞中幾乎檢測不到［9］。最近的研究［2-6］表明，神經膠質瘤、胃癌和乳腺癌等均發(fā)現(xiàn)Msi1異常高表達，并且Msi1高表達被認為與許多惡性腫瘤分期及增殖活性相關，并提示疾病的預后較差，提示Msi1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵作用，可能是一種原癌基因，但至今在結腸癌中的確切作用機制仍然未知。本研究利用慢病毒成功構建Msi1穩(wěn)定低表達的HCT116細胞株，發(fā)現(xiàn)沉默Msi1基因后，結腸癌HCT116細胞G0/G1期阻滯，S期細胞明顯減少，細胞分裂顯著減緩，并造成細胞體外增殖活性及克隆形成能力明顯下降。另外，裸小鼠移植瘤實驗表明，沉默Msi1基因可顯著抑制結腸癌HCT116細胞在體內的成瘤性。上述結果表明，Msi1在結腸癌演進過程中有重要影響，沉默Msi1基因對結腸癌細胞具有生長抑制作用。Chen等［10］在肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，當沉默Huh7細胞Msi1基因后，細胞增殖能力及克隆能力明顯受到抑制，并在G1/S期轉換時引起細胞周期停滯。Wang等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，干擾口腔鱗狀細胞癌中Msi1表達，將導致細胞增殖、遷移及侵襲能力顯著下降，出現(xiàn)細胞周期停滯于S期，因此認為Msi1是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的核心調節(jié)因子。以上研究報道與本研究結果相似。

目前Msi1通過何種機制發(fā)揮其癌基因的作用仍不很明確。Msi1是RNA轉錄后表達的關鍵調控者，主要通過與轉錄產物的非翻譯區(qū)域的序列發(fā)生特異結合，從而影響翻譯的過程。之前有研究［7］發(fā)現(xiàn)，Msi1可以通過與下游靶基因mRNA 3’-UTR區(qū)特異性結合抑制翻譯的過程，進而調控其下游基因表達，最終參與細胞增殖、細胞周期、細胞分化和細胞凋亡。最新研究［8］也表明，p27 mRNA 3’-UTR區(qū)存在Msi1的潛在結合位點。p27作為細胞周期負性調節(jié)因子，被認為是一種抑癌基因，并且在結腸癌組織中p27蛋白的表達明顯降低，且其表達的陽性率與結腸癌的分化程度、有無淋巴結轉移及預后有關［12-13］，其從生物功能上可能是最直接地影響G1/S期限制位點的調控因子，p27蛋白高表達可導致腫瘤細胞周期停滯在G1期，進而抑制腫瘤細胞增殖［14-16］。本實驗的結果也印證了上述觀點，沉默結腸癌細胞Msi1基因表達后，發(fā)現(xiàn)沉默組p27蛋白水平顯著上調，通過FCM觀察到沉默組腫瘤細胞發(fā)生了明顯的G0/G1期阻滯，細胞周期進程受阻，而且CCK-8實驗、克隆形成實驗和裸小鼠移植瘤實驗證實，沉默組細胞體內外增殖能力及克隆形成能力均受到明顯抑制。因此推測，Msi1可能正是通過與其靶基因p27 mRNA 3’-UTR區(qū)特異性結合，抑制其翻譯，降低其蛋白水平，進而參與結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。為驗證該假設，本實驗首先需要證明Msi1作用于p27 mRNA翻譯階段，而對p27 mRNA水平并無影響。因此，本實驗針對細胞周期調控因子設計了p27的特異性引物，采用RTFQ-PCR進行轉錄水平的檢測，并用Western blot檢測了蛋白水平。結果顯示，與Blank組及NC組相比，沉默組細胞中p27基因的mRNA水平無明顯改變，但是其蛋白水平明顯上調，說明Msi1可以抑制p27 mRNA的翻譯，從而負向調節(jié)p27的蛋白水平，而對p27 mRNA表達無影響。為進一步挖掘沉默Msi1上調p27蛋白水平的機制，進行了熒光素酶報告實驗，結果顯示，Msi1能明顯抑制p27 3’-UTR區(qū)野生型的熒光素酶活性，但p27 3’-UTR區(qū)中Msi1的結合區(qū)域突變時，Msi1抑制p27 3’-UTR區(qū)的熒光素酶活性現(xiàn)象消失，提示結腸癌中Msi1能夠與p27 mRNA 3’-UTR區(qū)特異性的結合，進而靶向抑制p27蛋白的水平從而發(fā)揮其癌基因的作用，這與Liu等［17］在宮頸癌中的研究結果相似。

綜上所述，p27是Msi1的靶基因，沉默Msi1后可以通過上調p27蛋白水平，導致結腸癌HC116細胞G0/G1期阻滯，從而抑制腫瘤細胞增殖。本研究存在一定局限性，如未對p27進行靶基因的功能驗證，有待后續(xù)進一步研究，從而系統(tǒng)地解析Msi1的信號轉導通路，為結腸癌的預防、診斷和治療提供新的靶點。