人ALOX5AP基因啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析

臧麗玉 徐晟林 耿學(xué)峰 姜恩德 吳從平 趙寶昌

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

腦卒中或腦血管意外，俗稱“中風(fēng)”，具有高殘率和高死亡率等特點(diǎn)[1]，全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康和生命安全。它的發(fā)病是由于腦部動(dòng)脈血管阻塞或血栓形成引起灌流區(qū)組織供血不足，或血管破裂引起出血性腦損傷等導(dǎo)致的腦血管疾病[2]。為深入探索其發(fā)病的分子機(jī)制，Helgadottir等[3]于2004年通過病例-對(duì)照研究，在冰島和英國(guó)人群中首次定位了腦卒中的易感基因—ALOX5AP(Arachidonate 5-lipoxygenase activating protein)，它編碼的蛋白質(zhì)(5-脂氧合酶激活蛋白)可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成白三烯。白三烯參與許多促炎過程，加速血栓的形成及動(dòng)脈粥樣硬化，最終導(dǎo)致心肌梗死或腦卒中。但ALOX5AP基因表達(dá)升高的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本研究通過克隆人ALOX5AP基因啟動(dòng)子并構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析其啟動(dòng)子序列、CpG島及潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為闡明ALOX5AP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)，為臨床治療缺血性腦卒中尋找新的策略。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與試劑

熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic購(gòu)于Promega公司，E-coli DH5α由山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于北京Tiangen公司，膠回收試劑盒購(gòu)于北京Genstar公司，DNA抽提試劑盒、puf 高保真DNA聚合酶、DNA 1kb Marker、MluⅠ及HindⅢ限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購(gòu)于Takara(大連生物工程公司)。引物合成與DNA測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索人類ALOX5AP基因，并在Ensembl網(wǎng)站中查找轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)在基因中的準(zhǔn)確位置(NCBI與Ensembl的網(wǎng)址見表3)，以轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)作為+1，獲取上游-2 000 bp至-1 bp的序列。針對(duì)此序列，利用軟件primer premier 6.0設(shè)計(jì)引物(表1所示)，用于人ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)域的PCR擴(kuò)增。為方便后續(xù)載體構(gòu)建，根據(jù)序列特點(diǎn)與pGL3-basic的多克隆位點(diǎn)，在引物的5’端引入合適的酶切位點(diǎn)(表1)。

表1 引物序列及修飾的酶切位點(diǎn)

1.3 人ALOX5AP基因啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建

用外周血基因組DNA提取試劑盒提取志愿者血液中的DNA，以此為模板，利用高保真聚合酶PCR擴(kuò)增人ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)域2 000 bp的DNA序列，PCR反應(yīng)程序如表2所示。純化回收PCR產(chǎn)物后，與pGL3-basic空載體同時(shí)以限制性內(nèi)切酶MluⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用試劑盒切膠回收兩目的片段。定量后，將兩片段以摩爾比1∶10的比例混合均勻，加入1 μL T4 DNA連接酶，16℃過夜連接以制備重組質(zhì)粒?？焖贌峒しㄔ诠腆w LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素 50 μg/mL)的培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒。第2天在培養(yǎng)皿上挑取單克隆，振蕩培養(yǎng)16～20 h，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，命名為pGL3-A2000。

表2 PCR反應(yīng)程序

1.4 載體的驗(yàn)證

取提取的pGL3-A2000質(zhì)粒，分別在37℃水浴鍋中進(jìn)行MluⅠ單酶切和MluⅠ+HindⅢ雙酶切，酶切2 h后將產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。酶切驗(yàn)證后，選擇電泳條帶與預(yù)期結(jié)果一致的為陽(yáng)性克隆，取陽(yáng)性克隆菌液寄送上海生工測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

1.5 ALOX5AP基因啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)分析

登錄Promoter 2.0[4]與NNPP (Neural Network Promoter Prediction)網(wǎng)站(網(wǎng)址見表3)，上傳ALOX5AP上游2 000 bp的啟動(dòng)序列，利用軟件對(duì)人ALOX5AP進(jìn)行潛在的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)和分析。Promoter 2. 0的參數(shù)設(shè)置取默認(rèn)值；NNPP的參數(shù)設(shè)置為啟動(dòng)子最小分值0.8。

1.6 ALOX5AP基因啟動(dòng)子CpG島分析

分別登陸CpGPlot[5]和Meth Primer[6]兩個(gè)在線軟件的網(wǎng)站(網(wǎng)址見表3)，在搜索框中輸入目的DNA序列。2個(gè)軟件對(duì)CpG島的認(rèn)定條件如下：①最低長(zhǎng)度為200 bp；②最低GC含量為50%；③實(shí)際GC含量與期望GC比例最小值為0.6。

1.7 ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

登錄AliBaba 2.1程序的網(wǎng)站(網(wǎng)址見表3)，通過在TRANSFAC 4.0站點(diǎn)構(gòu)建矩陣，獲取轉(zhuǎn)錄因子與ALOX5AP基因潛在的結(jié)合位點(diǎn)。

表3 生物信息學(xué)所用網(wǎng)址

2 結(jié) 果

2.1 ALOX5AP基因定位分析

Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ALOX5AP基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其在染色體NC_000013.11(30713478..30764428)區(qū)域內(nèi)，基因ID為241，基因序列全長(zhǎng)為50 950 bp，含有5個(gè)外顯子。其mRNA登錄號(hào)為NM_001204406.1，它編碼含有161個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。在Ensembl網(wǎng)站中查找轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位置，以FASTA的格式獲得并下載轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 000 bp的序列。本段序列中包括包含潛在的啟動(dòng)子序列，可用于后續(xù)分析。

2.2 重組質(zhì)粒pGL3-A2000的酶切驗(yàn)證

利用高保真Pfu酶，以人外周血DNA作為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域，將擴(kuò)增片段克隆至pGL3-basic質(zhì)粒中，將得到的重組質(zhì)粒pGL3-A2000進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)MluⅠ單酶切后得到6 800 kb的條帶，重組質(zhì)粒經(jīng)MluⅠ+HindⅢ雙酶切后，得到4 800 bp與2 000 bp的2個(gè)條帶，片段大小與預(yù)期一致，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。

2.3 重組質(zhì)粒pGL3-A2000的測(cè)序驗(yàn)證

將MluⅠ+HindⅢ雙酶切驗(yàn)證正確后的陽(yáng)性菌液寄送上海生工有限公司，測(cè)序結(jié)果如圖2所示(用chromas軟件打開)。在BLAST中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示載體插入序列與基因組序列完全一致，進(jìn)一步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 人ALOX5AP基因啟動(dòng)子分析

目前，生物學(xué)領(lǐng)域分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子候選區(qū)較常用的軟件主要有Promoter 2.0與NNPP(Neural Network Promoter Prediction)等[7]。Promoter 2.0結(jié)果表明，ALOX5AP基因-500處有高度可能的啟動(dòng)子區(qū)，分值為1.117。NNPP軟件顯示，在-996 bp至-946 bp 的區(qū)域內(nèi)啟動(dòng)子分值存為1的啟動(dòng)子區(qū)，其中在-954 bp 至-904 bp 的區(qū)域內(nèi)啟動(dòng)子分值存為0.98的啟動(dòng)子區(qū)(表4)。為更好的進(jìn)行分析，我們將這3個(gè)序列均視為候選區(qū)域，進(jìn)行下一步的探索。

2.5 ALOX5AP基因上游啟動(dòng)區(qū)CpG島檢測(cè)

預(yù)測(cè)基因是否含有CpG島及確定CpG島的數(shù)目可更好的了解基因的表達(dá)調(diào)控，為了解人ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，本研究應(yīng)用CpGPlot和Meth Primer 2個(gè)在線軟件對(duì)CpG島進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示均未在ALOX5AP上游啟動(dòng)區(qū)域發(fā)現(xiàn)CpG島(圖3與圖4)。

2.6 ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

我們利用AliBaba 2.1程序在TRANSFAC 4.0站點(diǎn)構(gòu)建矩陣，在ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)共獲得245個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，說明人ALOX5AP基因的轉(zhuǎn)錄因子比較豐富，表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜。為使目標(biāo)更加精確，我們著重記錄了前述3個(gè)候選區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見表4。

泳道1：載體經(jīng)MluⅠ單酶切后電泳；泳道2：DNA 1kb Marker；

泳道3：經(jīng)MluⅠ+HindⅢ雙酶切后電泳。

圖1 pGL3-A2000的酶切驗(yàn)證

表4 NNPP對(duì)ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)域的預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 pGL3-A2000的測(cè)序驗(yàn)證

表4 3個(gè)啟動(dòng)子候選區(qū)域內(nèi)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

3 討 論

啟動(dòng)子是基因表達(dá)必不可缺的調(diào)控序列，沒有啟動(dòng)子，RNA聚合酶就無(wú)法結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄，因此鑒定基因的啟動(dòng)子是后基因組時(shí)代的基本問題之一。生物信息學(xué)軟件的開發(fā)與利用，可以根據(jù)DNA的保守序列特征預(yù)測(cè)基因的啟動(dòng)子，以此為候選區(qū)域后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供思路。本研究也利用這2種軟件Promoter 2.0與NNPP(neural network promoter prediction)預(yù)測(cè)了ALOX5AP基因的啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3個(gè)啟動(dòng)子候選區(qū)。由于2個(gè)軟件的預(yù)測(cè)原理和側(cè)重點(diǎn)有差異，所以預(yù)測(cè)結(jié)果也不盡相同。

DNA甲基化是真核生物中一種重要的表觀遺傳修飾，它只發(fā)生在CpG雙核苷酸的胞嘧啶上。基因組中幾乎所有管家基因和約一半的組織特異性基因啟動(dòng)子區(qū)具有比較高比例的GC含量，這些高GC含量的區(qū)域組成一些CpG島并處于低甲基化狀態(tài)。而高甲基化狀態(tài)的CpG島則會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使基因無(wú)法轉(zhuǎn)錄而失去生物學(xué)效應(yīng)[8]，因此CpG島的甲基化狀態(tài)與許多疾病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未在ALOX5AP上游啟動(dòng)區(qū)域發(fā)現(xiàn)CpG島，說明ALOX5AP基因可能不受甲基化修飾影響。

啟動(dòng)子屬于DNA序列的一段，必須與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合才能激活基因轉(zhuǎn)錄，這是基因表達(dá)調(diào)控最關(guān)鍵的起始事件。轉(zhuǎn)錄因子是參與基因表達(dá)調(diào)控的一類重要蛋白質(zhì)，它與DNA結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)將有助于我們認(rèn)識(shí)和研究不同轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的時(shí)空性，預(yù)測(cè)到的轉(zhuǎn)錄因子都可以作為治療疾病的潛在的靶標(biāo)分子。本實(shí)驗(yàn)著重闡述3個(gè)候選區(qū)域這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可能明顯影響ALOX5AP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們需充分參考此結(jié)果來構(gòu)建一系列截短的熒光素酶表達(dá)載體，保證這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在載體中的完整性。需要注意的是計(jì)算機(jī)的預(yù)測(cè)有一定的局限性，人ALOX5AP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是否受到這些轉(zhuǎn)錄因子的影響，尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

腦卒中是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的難治性疾病，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。腦卒中發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一是炎癥反應(yīng)，它通過促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化繼發(fā)血管阻塞和破裂而引起腦血管疾病的發(fā)生[9]。研究人員已在多項(xiàng)研究中[10-12]發(fā)現(xiàn)，ALOX5AP基因與腦卒中有關(guān)，其編碼的5-脂氧合酶激活蛋白可與花生四烯酸特異性結(jié)合，激活5-脂氧合酶后催化花生四烯酸生成白三烯，細(xì)胞炎癥因子白三烯與受體結(jié)合后參與炎癥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化形成，最終將導(dǎo)致血管狹窄、破裂，加快腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。由此可見，ALOX5AP基因的表達(dá)升高是其始動(dòng)因素，這很可能發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要通過轉(zhuǎn)錄起始部位一些特殊的調(diào)控序列如啟動(dòng)子和作用于啟動(dòng)子區(qū)的一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用引起。深入研究ALOX5AP啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等對(duì)于回答腦卒中的一些基本理論問題具有重要意義。

本研究為探討ALOX5AP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，首先設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因 5’端上游DNA序列的引物，以基因組DNA為模板擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域，PCR產(chǎn)物與 pGL3-Basic質(zhì)粒連接構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功。生物信息學(xué)軟件對(duì)ALOX5AP基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析表明，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 000 bp的序列內(nèi)有3個(gè)啟動(dòng)子候選區(qū)，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選出Pit-1α、TBP、TBPWT1-κ、Sox-2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示ALOX5AP基因可能受這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,為治療缺血性腦卒中提供了新的潛在靶點(diǎn)。