HPLC同時測定新泰不同區(qū)域丹參藥材中8種成分的含量

李志東

新泰市人民醫(yī)院，山東 泰安 271200

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，藥用部位是干燥根及根莖[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論和現(xiàn)代研究證實，丹參具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止血、消腫止痛、擴張冠狀動脈及改善心肌缺血等作用。丹參主要含有脂溶性的丹參酮類和水溶性酚酸類化學(xué)成分，2015年版《中華人民共和國藥典》將丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮I的總量及丹酚酸B作為丹參的質(zhì)量評價指標(biāo)。此外，脂溶性的二氫丹參酮Ⅰ，以及水溶性的丹參素、丹酚酸A、原兒茶醛和迷迭香酸等均為丹參的藥效成分，發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抑制肝損傷和肺纖維化、調(diào)節(jié)組織修復(fù)和再生等功能[2-7]。為了更好地評價丹參的質(zhì)量，本實驗選取其活性成分丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，建立起同時測定這8種成分含量的HPLC條件，并對新泰市不同區(qū)域的丹參藥材進行了含量測定及分析，旨在為全面控制和綜合評價丹參藥材質(zhì)量提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate3000超高效液相色譜儀(賽默飛)；GR-202日本AND分析天平(精密度：0.1 mg)； KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；手動移液器(Eppendorf公司，200 μL、1000 μL)；50 g裝中藥粉碎機(瑞安市百信制藥機械有限公司)；UPR-II-10T超純水機(四川優(yōu)普超純科技公司)。

1.2 試藥

對照品丹參素(批號：wkq18061906)、原兒茶醛(批號：wkq18081005)、迷迭香酸(批號：wkq18042802)、丹酚酸B(批號：wkq18042503)、二氫丹參酮Ⅰ(批號：wkq18070205)、隱丹參酮(批號：wkq18021408)、丹參酮Ⅰ(批號：wkq18050206)、丹參酮ⅡA(批號：18012309)均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%。甲醇為色譜純，水為超純水。

25組丹參藥材于2018年11月分別采集于山東省新泰市禹村(樣品1～5)、石萊(樣品6～10)、龍廷(樣品11～15)、放城(樣品16～20)和汶南(樣品21～25)5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，樣品經(jīng)臨沂大學(xué)王文房教授鑒定為丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

UltiMate3000超高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫，梯度程序見表1；流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫為30℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備[8-11]

2.2.1對照品 分別取丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的對照品適量，精密稱定，加甲醇(丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B加80%甲醇水)配制成質(zhì)量濃度分別為520、780、420、1980、520、360、300、540 μg/mL的各對照品儲備液。再精密吸取各對照品儲備液適量，置10 mL棕色量瓶中，得到每1 mL中含丹參素26 μg、原兒茶醛39 μg、迷迭香酸21 μg、丹酚酸B 90 μg、二氫丹參酮Ⅰ 26 μg、隱丹參酮18 μg、丹參酮Ⅰ 15 μg、丹參酮ⅡA 27 μg的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 丹參樣品用中藥粉碎機打粉，過3號篩，各取0.2 g，精密稱定，加70%甲醇水20 mL，浸泡24 h，40℃超聲30 min，放冷，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

在上述的色譜條件下，分別檢測對照品、供試品和陰性對照品溶液(甲醇溶液)，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 對照品(A)與供試品(B)色譜圖

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取各對照品儲備液，稀釋為各濃度梯度，按“2.1”項下色譜條件進行測定，分別以丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的質(zhì)量濃度(μg/mL)和相應(yīng)的峰面積進行線性回歸，計算回歸方程，見表2。

表2 8種成分線性關(guān)系表

2.3.2精密度試驗 取一組供試品溶液(樣品14)，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算峰面積。結(jié)果顯示，供試品色譜峰峰面積的RSD小于3.0%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗 取一組丹參樣品(樣品14)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于 0、4、8、12、18、24 h進樣，計算各色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，各色譜峰峰面積的RSD小于3.0%，表明供試品溶液 24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性試驗 取一組丹參樣品(樣品14)6份，分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下方法測定。結(jié)果顯示丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.168 1、0.034 9、1.757 7、56.446 4、0.278 4、1.816 2、0.766 3和3.096 8 mg/g，各色譜峰峰面積的RSD小于3.0%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.5回收率試驗 精密稱取一組丹參樣品(樣品14)0.1 g，共6份，分別加入丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行測定，分別計算回收率。結(jié)果如表3，8種成分的回收率及RSD均符合要求。

表3 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品含量測定

取25組丹參樣品，按“2.2.2”項下方法制備，精密吸取對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標(biāo)法計算各成分含量，結(jié)果見表4。

表4 含量測定結(jié)果(n=3)

3.2 樣品含量分析

2015年版中國藥典規(guī)定丹參藥材中含丹酚酸B不得少于3.0%，含丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮I的總量不得少于0.25%[1]。本實驗采用的提取及檢測方法與藥典不同，但調(diào)查結(jié)果顯示新泰市5鄉(xiāng)鎮(zhèn)丹參藥材平均值都達到藥典要求。采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計對新泰市25組產(chǎn)地的丹參以丹酚酸B、總丹參酮(隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮ⅡA的成分含量之和)及總成分(8種檢測成分)的量為變量進行聚類分析，結(jié)果見圖2。

利用系統(tǒng)聚類法，可將藥材分為3組，第一組包括1、3、7、22、23、24和25，丹酚酸B的量為32.75～39.26 mg/g，總丹參酮含量范圍為2.174 3～5.529 4 mg/g，總成分范圍為38.53～46.73 mg/g。主要包括石萊鎮(zhèn)左家溝村、禹村鎮(zhèn)朱家莊和垤路村、汶南鎮(zhèn)東官莊、東魯莊、西官莊和魯家溝；第二組包括4、5、6、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20和21，丹酚酸B的量為40.70～53.16 mg/g，總丹參酮含量范圍為2.660 0～10.276 0 mg/g，總成分范圍為52.50～61.20 mg/g。主要包括放城鎮(zhèn)5個村、禹村鎮(zhèn)南泉頭村和北峪村、汶南鎮(zhèn)國家莊、石萊鎮(zhèn)蘇家莊、徐家?guī)X村、張家峪村和北清泥溝村、龍廷鎮(zhèn)龍廷村、楊莊子村、下豹峪村和上豹峪村；第三組包括2和14，丹酚酸B的量為56.45～57.84 mg/g，總丹參酮含量范圍為5.679 3～6.798 8 mg/g，總成分范圍為64.36～67.54 mg/g，主要包括禹村鎮(zhèn)南峪村和龍廷鎮(zhèn)大河?xùn)|村。

4 討 論

4.1 浸提及色譜條件

結(jié)合相關(guān)文獻，本實驗對供試品的制備方法進行了篩選，分別為(1)不同提取方式(回流和先冷浸后超聲)：結(jié)果顯示兩種方法提取效率差距不明顯，為方便起見采取常溫下冷浸24 h再超聲30 min；(2)不同提取溶劑(50%、70%、90%甲醇)：結(jié)合丹參中8種待測成分的理化性質(zhì)，綜合比較70%甲醇提取比較均衡。

圖2 25組樣本系統(tǒng)聚類樹狀圖

本實驗對供試品的色譜條件進行優(yōu)化，結(jié)果為(1)通過全波長掃描，根據(jù)所測成分的色譜行為，280 nm處有較理想吸收；(2)選用Inertsil ODS-3 C18色譜柱，考察不同溶劑流動相，包括甲醇(乙腈)-水、甲醇(乙腈)-0.1%甲酸水溶液以及甲醇(乙腈)-0.5%甲酸水溶液，結(jié)果乙腈-0. 1%甲酸水溶液和甲醇-0. 1%甲酸水溶液對8種成分均有較好的分離，由于乙腈的毒性和成本選擇甲醇-0. 1%甲酸水溶液梯度洗脫；(3)考察不同柱溫(30、35、40℃)下的圖譜，結(jié)果表明30℃下分離度最好。

本實驗建立的同時測定丹參藥材中8種成分的分析方法，簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠，為丹參藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

4.2 新泰市丹參種植分析

通過檢測結(jié)果及聚類分析可以看到，新泰市作為丹參藥材的地道產(chǎn)區(qū)，藥材質(zhì)量達到了高水準(zhǔn)，分類的三組含量差距不大，尤其中間組(第二組)包涵了25個樣品地的16個，保持了藥材質(zhì)量的穩(wěn)定；第三組不但丹酚酸B含量高，而且總丹參酮含量均值也是最高的，主要集中在龍廷和禹村的一小部分，可以進一步分析其高質(zhì)量的原因，總結(jié)優(yōu)勢；第一組相比較其他兩組含量略少，主要分布在汶南的大部分及禹村、石萊的一部分，究其原因可能是常年連作沒有注意休整土地。本實驗只做了新泰市內(nèi)各區(qū)域的丹參質(zhì)量對比，后續(xù)實驗還會與全國其他主要產(chǎn)區(qū)的丹參做比較分析。

山東泰沂山脈是我國傳統(tǒng)的道地丹參藥材產(chǎn)區(qū)，新泰市位于泰沂山脈腹地。當(dāng)前新泰市年產(chǎn)量達1.5萬噸，丹參栽培面積約5萬畝，主要集中在龍廷、汶南、石萊、放城、禹村和樓德等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，即新泰市的東南和西南部。此地為丘陵地帶，土壤以棕壤土、砂性壤質(zhì)土為主，特殊的地理地貌、土壤類型和適宜的氣候條件為丹參提供了優(yōu)良的生長環(huán)境，也造就了當(dāng)?shù)赜凭玫牡⒎N植歷史。近年來，新泰市立足丹參道地藥材產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢，圍繞區(qū)域特色化、生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，推動以丹參為主的中草藥產(chǎn)業(yè)精品化發(fā)展，建成全省重要的中草藥種植基地。本實驗對不同區(qū)域丹參質(zhì)量進行檢測，旨在為進一步分析其質(zhì)量優(yōu)劣的成因、加強各種植區(qū)域經(jīng)驗交流、技術(shù)合作和資源整合，進而為規(guī)范化規(guī)模化種植丹參、做大做強丹參產(chǎn)業(yè)打下基礎(chǔ)。