拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)的制備及大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

姜 珊，周伶俐，唐 星，張 宇

拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)的制備及大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

姜 珊，周伶俐，唐 星，張 宇*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

研制拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)并對(duì)其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察?？疾炖逅愒诓煌拖?、乳化劑中的溶解度，同時(shí)加入一種腸道黏膜黏附劑單油酸甘油酯用于增加口服的吸收量，再通過繪制偽三元相圖，并通過均勻設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)處方，進(jìn)一步篩選確定最優(yōu)的處方，制備拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)；考察自乳化制劑的外觀、粒徑、電位、自乳化時(shí)間、含藥量和穩(wěn)定性，并比較拉洛他賽口服溶液劑與自乳化制劑的大鼠體內(nèi)生物利用度。以三辛酸甘油酯-單油酸甘油酯-吐溫80（∶∶= 15∶55∶30）形成均一穩(wěn)定的拉洛他賽自乳化制劑。偏光顯微鏡下無藥物析出，拉洛他賽自乳化制劑經(jīng)pH值1.2的模擬胃液、蒸餾水及pH值6.8的模擬腸液的不同倍數(shù)稀釋后，穩(wěn)定性無明顯變化；外觀呈現(xiàn)淡藍(lán)色略帶乳光溶液，粒徑為（169.7 ± 15.36）nm（=3），多分散性指數(shù)PDI為0.169，zeta電位為（-24.2 ± 1.23）mV（=3），含藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.987 ± 0.0183）%（=3）；相比于溶液劑，自乳化制劑生物利用度顯著提高，約是溶液劑的4.7倍。拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)易于制備、質(zhì)量穩(wěn)定，可顯著增加拉洛他賽的口服生物利用度，為口服拉洛他賽新型制劑的研發(fā)提供了思路。

藥劑學(xué)；自乳化釋藥系統(tǒng)；偽三元相圖；拉洛他賽；制備；質(zhì)量評(píng)價(jià)；生物利用度

拉洛他賽（larotaxel，LTX）是新一代的紫杉烷類抗腫瘤藥物，通過與微管內(nèi)表面蛋白結(jié)合使微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抑制微管在正常有絲分裂過程中的解聚，從而使細(xì)胞滯留在晚期即G2/M期，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與紫杉醇、多西他賽相比，拉洛他賽具有更低的P-gp及CYP450親和力，對(duì)常見的腫瘤細(xì)胞及多種耐藥基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞如人體乳腺癌耐多柔比星細(xì)胞株MCF-7/Doxrubicin、人體肺癌耐紫杉醇細(xì)胞株A549/Taxol等也具有較高活性的抑制作用[1]。包括拉洛他賽在內(nèi)的紫杉烷類藥物均屬于BCS IV類藥物，同時(shí)具有較低的水溶性和腸道滲透性，而大部分上市的制劑也多為注射給藥，目前處于臨床試驗(yàn)階段的拉洛他賽脂質(zhì)微球也為注射劑。通常注射劑為了解決這些藥物水難溶性問題會(huì)在處方中加入乙醇及低分子量表面活性劑，而這些表面活性劑直接進(jìn)入體循環(huán)會(huì)帶來很多嚴(yán)重的超敏、體液潴留等不良反應(yīng)[2]。而口服制劑作為最方便的給藥方式，具有成本低、順應(yīng)性高等特點(diǎn)[3]，因此考慮將拉洛他賽制備為口服制劑。

自乳化釋藥系統(tǒng)（self-emulsifying drug delivery system，SEDDS）是由藥物、油相（oil）、表面活性劑（surfactant）和助表面活性劑（cosurfactant）組成的均一、穩(wěn)定透明的液體給藥系統(tǒng)。自乳化釋藥系統(tǒng)可增加難溶性藥物的溶解度，提高藥物的吸收速度和程度，以此來提高生物利用度，是極具潛力的一種新型親脂性藥物載體。其主要的特征是在體溫下經(jīng)胃腸道蠕動(dòng)或體外環(huán)境溫度適宜（常指37 ℃）以及溫和攪拌的情況下，在表面活性劑的作用下自發(fā)乳化形成粒徑小于5 μm的O/W型乳劑[4-5]，且隨著表面活性劑和助表面活性劑的含量增加會(huì)得到乳滴粒徑更?。?100 nm）的透明澄清乳液[6]。韓國科學(xué)技術(shù)研究院所研制的紫杉醇自乳化釋藥系統(tǒng)口服絕對(duì)生物利用度可達(dá)30%，現(xiàn)已進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段，可見抗腫瘤藥物的自乳化釋藥系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用前景。作者選用低毒性的油相和表面活性劑以及具有腸道黏膜黏附性的單油酸甘油酯制備拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)并考察其理化性質(zhì)和穩(wěn)定性，研究其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，目的希望能提高拉洛他賽的口服生物利用度。

1 儀器與材料

ACCULAB ATL-124分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），L-2000高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），pH-10酸度計(jì)（德國Sartorius生物技術(shù)有限公司），KQ-300DE超聲清洗器、ZHWY- 110X30水浴恒溫培養(yǎng)搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），DF-101s集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），馬爾文粒度測定儀（英國Malvern公司），EYELA OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（日本東京理化器械株式會(huì)社），高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），BA300Pol偏光顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），ACQUITYTM UPLC 系統(tǒng)（Waters Corp. Milford，MA，USA），Waters ACQUITYTM TQD UPLC/MS/MS（Waters Corp. Manchester，UK）。

拉洛他賽（larotaxel，LTX，山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司），LTX-SEDDS（自制），多西他賽（上海三維藥業(yè)有限公司），單油酸甘油酯（嘉法獅上海貿(mào)易有限公司），三辛酸甘油酯（美國Sigma公司），吐溫80（上海申宇醫(yī)藥化工有限公司），胃蛋白酶（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），胰蛋白酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），二氯甲烷（分析純，天津富宇化學(xué)試劑有限公司），甲醇、乙腈（色譜純，市售），其余試劑（分析純，市售），水為蒸餾水（自制）。

動(dòng)物為雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，體質(zhì)量為200～220 g，由沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK（遼）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 LTX-SEDDS制備

2.1.1 LTX在各種輔料中溶解度的測定

將過量的LTX原料藥分別加入到盛有各種油相和表面活性劑的具塞玻璃試管中，制成LTX飽和溶液，渦旋后，置于37 ℃的水浴恒溫培養(yǎng)搖床中震蕩平衡72 h，置于室溫下平衡后取上清并于1.2×104r·min-1離心20 min，精密吸取一定量并選擇適宜的溶劑稀釋后，分別用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行含量測定，計(jì)算溶解度，結(jié)果見表1。

Table 1 Solubility of larotaxel in different solvents (37 ℃, n=3)

表1結(jié)果表明，在油相溶劑中，LTX在三辛酸甘油酯中溶解度最大，選擇三辛酸甘油酯作為油相，LTX在單油酸甘油酯中溶解度雖然沒有很大，但是由于單油酸甘油酯具有腸道黏膜黏附性的作用，有利于增加藥物的吸收，因此將單油酸甘油酯與三辛酸甘油酯共同作為油相。在表面活性劑中，LTX在吐溫80中溶解度相對(duì)較大，固選擇吐溫80作為表面活性劑。

2.1.2 LTX-SEDDS偽三元相圖的繪制

根據(jù)LTX在各種輔料中的溶解度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選擇油相和表面活性劑中對(duì)藥物溶解度最好的三辛酸甘油酯和吐溫80作為油相和乳化劑，并選擇具有腸道黏膜黏附作用的單油酸甘油酯聯(lián)合使用，配置一系列不同比例的單油酸甘油酯和三辛酸甘油酯的混合物，將其與表面活性劑按不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)置于具塞玻璃試管中渦旋混勻，在37 ℃、50 r·min-1溫和攪拌下逐漸加入定量的蒸餾水，參照多數(shù)文獻(xiàn)采用的自乳化制劑的評(píng)價(jià)方法即目測法對(duì)成乳情況進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，將自乳化情況分為5個(gè)級(jí)別[7]：A級(jí)為溶液呈澄清或微泛藍(lán)色；B級(jí)為略濁，呈藍(lán)白色；C級(jí)為呈亮白色不透明液體；D級(jí)為色澤暗，呈灰白色，略帶油狀；E級(jí)為難乳化，一直有油滴存在。記錄不同比例混合系統(tǒng)的變化情況和狀態(tài)，分別以單油酸甘油酯、三辛酸甘油酯和吐溫80作為相圖的3個(gè)頂點(diǎn)，繪制偽三元相圖，結(jié)果見圖1。

圖1結(jié)果表明，A、B、C、D和E的不同區(qū)域分別對(duì)應(yīng)自乳化情況的5個(gè)等級(jí)，從圖中可知，當(dāng)吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于25%時(shí)，會(huì)一直有油滴存在，很難形成乳劑，隨著吐溫80量不斷增加，乳劑越容易形成，當(dāng)吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)>40%時(shí)，乳劑反而會(huì)更不穩(wěn)定，漸漸出現(xiàn)分層現(xiàn)象，測得的粒徑也偏大；當(dāng)單油酸甘油酯含量較高時(shí)，形成的乳劑很容易出現(xiàn)肉眼可見的略帶油滴的狀態(tài)，所測得的乳劑粒徑分散且偏大，約為1 μm，穩(wěn)定性很差；而當(dāng)三辛酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)<50%時(shí)，雖然能形成乳劑，但當(dāng)放置4 h后會(huì)出現(xiàn)分層，粒徑增大，甚者破乳出現(xiàn)油滴的狀態(tài)，因此從制劑的穩(wěn)定性和安全性出發(fā)，將吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍初步定為25%～40%，單油酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～20%，三辛酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～65%，并選擇其中A等級(jí)中的處方利用均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)一步優(yōu)化處方。

Fig. 1 Pseudo-ternary phase diagram of LTX-SEDDS

2.1.3 LTX-SEDDS處方優(yōu)化

選擇相圖中自乳化級(jí)別為A的區(qū)域，使用均勻設(shè)計(jì)U4(43)表，即3因素4水平下設(shè)計(jì)得到如表2的4個(gè)處方，配制總量為1 g的自微乳，每種處方中拉洛他賽的含量均為10 mg，其他成分按照總量的百分比稱取，分別按照制備方法得到拉洛他賽自乳化制劑。取0.2 g的LTX-SEDDS于37 ℃、50 r·min-1溫和攪拌15 min，并以自乳化后的粒徑、電位、自乳化時(shí)間、是否能形成均一穩(wěn)定的制劑為指標(biāo)選擇最優(yōu)處方，結(jié)果見表2。

Table 2 Optimization of LTX-SEDDS

以粒徑大小、制劑自乳化后的穩(wěn)定性以及自乳化時(shí)間作為考察指標(biāo)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)處方實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處方1～4（表2），各自乳化制劑均為微微泛藍(lán)色乳光的溶液，但處方1和4經(jīng)蒸餾水稀釋100倍后，24 h內(nèi)乳劑緩慢分層，有藥物析出，粒徑偏大且較為分散，自乳化時(shí)間也偏長；處方2和3在24 h內(nèi)均未出現(xiàn)分層，無藥物析出，較為穩(wěn)定，對(duì)比處方2和3的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，兩者乳化時(shí)間接近，處方2具有較小的粒徑，且具有較低含量的表面活性劑（30%），因此考慮到粒徑大小和表面活性劑的用量，選擇處方2作為較優(yōu)處方。因此最佳處方定為（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：單油酸甘油酯為15%，三辛酸甘油酯為55%，吐溫80為30%，拉洛他賽占總處方質(zhì)量的1%，并以此處方制備3批LTX-SEDDS。

2.1.4 LTX-SEDDS的制備工藝

精密稱取三辛酸甘油酯0.55 g和拉洛他賽原料藥10 mg置于圓底燒瓶中，加入適量的二氯甲烷超聲溶解后，30 ℃旋蒸1 h除去有機(jī)溶劑，再將單油酸甘油酯0.15 g和吐溫80 0.3 g溶解其中后渦旋混合均勻，制成總質(zhì)量約為1 g的拉洛他賽自乳化制劑，真空再次除去殘留溶劑（30 ℃，1 h），即得。

2.2 LTX-SEDDS的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 外觀性狀

觀察3批LTX-SEDDS制劑以及經(jīng)模擬胃液、腸液和蒸餾水稀釋、溫和攪拌下形成微乳后的外觀形狀，結(jié)果見圖2。

Fig. 2 The appearance of LTX-SEDDS (SGF, SIF and distilled water from left to right, n=3)

3批LTX-SEDDS均為淡黃色澄清透明的黏稠液體。經(jīng)模擬胃液、腸液和蒸餾水在溫和攪拌形成微乳后，均為澄明或略帶淡藍(lán)色乳光的液體。

2.2.2 粒徑分布以及zeta電位的測定

配置自微乳的溶液約3 mL，采用馬爾文粒度測定儀對(duì)制備的自微乳的粒度分布及zeta電位進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3、4。

Fig. 3 Particle size distribution of LTX-SEDDS

Fig. 4 Potential distribution of LTX-SEDDS

用馬爾文粒度測定儀測定自微乳的粒徑為（169.7 ± 15.36）nm（=3），多分散性指數(shù)PDI為0.169，zeta電位為（-24.2 ± 1.23）mV(=3)。

2.2.3 自乳化時(shí)間的測定

于恒溫磁力攪拌37 ℃、50 r·min-1下向盛有0.2 g的油相混合物的自乳化制劑分別緩慢加入100 mL蒸餾水、模擬胃液和模擬腸液3種分散介質(zhì)，進(jìn)行自乳化，等到分散介質(zhì)完全注入后開始計(jì)時(shí)，分別每隔1 min取樣3.5 mL，至15 min，在檢測波長為700 nm下測定透光率（），將15 min時(shí)透光率記為0，為100%，以此計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)透光率的相對(duì)百分率，并對(duì)乳化時(shí)間作圖，考察LTX-SEDDS自乳化速率，并觀察在不同分散介質(zhì)中的自乳化時(shí)間，結(jié)果見圖5。

—Distilled water;?—SGF;—SIF

實(shí)驗(yàn)中采用透光率來衡量自微乳的自乳化時(shí)間，由圖5可以看出，在不同的分散介質(zhì)中自微乳在溫和攪拌的條件下，3 min內(nèi)透光率都趨于穩(wěn)定，與15 min相比，自乳化速率均可達(dá)到100%，這表明該制劑在3 min內(nèi)能達(dá)到完全乳化分散。

2.2.4 偏光顯微鏡的觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中選擇偏光顯微鏡主要是用來定性判定自乳化制劑中有無藥物析出，將油相混合物的自微乳制劑和自微乳分散體制片，24 h后在偏光顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖6。

Fig. 6 Polarizing microscope of LTX-SEDDS LTX (A), LTX-SEDDS after 24 h (B) and emulsification of LTX- SEDDS after 24 h (C)

由圖6A可以看出，拉洛他賽在偏光顯微鏡下觀察到偏光現(xiàn)象，根據(jù)已做過的研究發(fā)現(xiàn)制備自乳化制劑的輔料沒有觀察到偏光現(xiàn)象，圖6B和6C可以看出，偏光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)油相混合物的自乳化制劑和經(jīng)乳化后的自微乳制劑在暗視野下均未觀察到偏光現(xiàn)象。結(jié)果表明24 h后拉洛他賽都能完全分散于油相中，沒有藥物沉淀析出，說明形成的自微乳制劑能較好地包裹藥物。

2.2.5 含量測定

色譜條件：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（體積比65∶35），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

方法學(xué)驗(yàn)證：參照拉洛他賽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定方法進(jìn)行方法學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，LTX的空白自微乳不干擾測定，在該實(shí)驗(yàn)條件下，LTX的最低檢測限為50 ng，LTX的保留時(shí)間為7.070 min，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=24.931+15.124（2=0.999 6）（=3），平均回收率為100.1%，RSD%為0.11%，表明高、中、低濃度下的回收率良好。分別測定了溶液在室溫和37 ℃條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明拉洛他賽非常穩(wěn)定，測定儀器和方法精密度也符合要求，RSD分別1.15%和0.66%，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明可用于拉洛他賽自乳化制劑的含量測定。

精密稱取適量的拉洛他賽自微乳制劑，甲醇稀釋后經(jīng)微孔濾膜過濾后按上述色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.987 ± 0.0183）%（=3）。

2.2.6 穩(wěn)定性考察

2.2.6.1 胃腸道穩(wěn)定性

取自微乳制劑1 mL分別加入到2 mL的模擬胃液、腸液中，渦旋混勻1 min，然后置于水浴搖床中37 ℃孵育，分別在模擬胃液中孵育0、0.5、1、2、4 h和模擬腸液中孵育0、1、2、4、6、8 h時(shí)間點(diǎn)取樣200 μL，將上述樣品加入5倍冰甲醇終止反應(yīng)，渦旋混勻1 min，取樣適量，1.2×104r?min-1冷凍離心（4 ℃）10 min，取上清液，進(jìn)樣分析。

按照胃腸道穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的方法，以0 h樣品的峰面積為100%計(jì)算，經(jīng)過4 h孵育后，模擬胃液中拉洛他賽的剩余百分率為100.50%，4 h后的粒徑為177.0 nm，經(jīng)過在模擬腸液中8 h孵育發(fā)現(xiàn)拉洛他賽的剩余百分率為99.70%，8 h后的粒徑為172.7 nm。藥物的剩余百分率結(jié)果見圖7。由圖7可知，拉洛他賽自微乳制劑在模擬胃液中4 h和模擬腸液中8 h內(nèi)藥物含量在98%～102%，基本沒有明顯變化，粒徑大小也基本沒有變化，表明制備的自微乳制劑在進(jìn)入胃腸道自乳化后不受分散介質(zhì)的影響，能保持穩(wěn)定的狀態(tài)。

?—SGF;—SIF

2.2.6.2 稀釋體積對(duì)LTX-SEDDS穩(wěn)定性的影響

將LTX-SEDDS 0.5 g分別用20、50、100 mL蒸餾水、模擬胃液和腸液稀釋后，于37 ℃下靜置24 h，觀察分層和相分離；并將稀釋后24 h的自微乳置于具塞試管中，6 000 r·min-1離心20 min，觀察。

LTX-SEDDS分別用不同體積的蒸餾水、模擬胃液和腸液稀釋后結(jié)果見表3。由表3可知，隨著稀釋體積的增加，LTX-SEDDS自乳化后24 h內(nèi)均未見有沉淀產(chǎn)生且無分層和相分離現(xiàn)象，且離心20 min仍未發(fā)生分層，均呈現(xiàn)略帶淡藍(lán)色乳光的溶液。

Table 3 Effectsof different dilution volumes on stability of LTX-SEDDS afteremulsification (37 ℃, n=3)

2.3 LTX-SEDDS體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.3.1 拉洛他賽色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜系統(tǒng)為ACQYUITYTM UPLC系統(tǒng)，色譜柱為Thermo C18柱（50 mm′2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A液為5 mmol?L-1醋酸銨水溶液，流動(dòng)相B液為乙腈，梯度洗脫條件見表4，流速為0.2 mL?min-1，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣室溫度為10 ℃。

Table 4 The gradient conditions of UPLC

質(zhì)譜條件：采用WATERS ACQUITYTM 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Corp., Manchester, UK)，離子源及檢測模式為ESI+，二級(jí)錐孔電壓2.0 V，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓25 V，離子源溫度150 ℃，噴霧氣與反吹氣為氮?dú)?，去溶劑氣溫度?00 ℃，其流速為700 L?h-1，反吹氣流速為50 L?h-1，碰撞氣為氬氣，其流速0.24 L?h-1，碰撞能量為10 eV，檢測及定量方法為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。用于定量分析的拉洛他賽和內(nèi)標(biāo)的離子反應(yīng)條件見表5。

Table 5 The ion reaction conditions of LTX and IS (DTX)

2.3.2 對(duì)照溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

對(duì)照溶液的配制：精密稱取拉洛他賽10.00 mg，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000和50 000 μg?L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取多西他賽10.00 mg，用甲醇稀釋配制成1 mg?L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 給藥方案與血漿樣品采集

采用平行對(duì)照試驗(yàn)法，10只大鼠隨機(jī)分成制劑組和溶液組，實(shí)驗(yàn)前禁食（不禁水）一夜。分別按照40 mg?kg-1的給藥劑量對(duì)大鼠灌胃拉洛他賽的制劑組和溶液劑組，分別于給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24 h，眼眶取血0.5 mL，置預(yù)先肝素化的1.5 mL尖底離心管中，6 000 r?min-1離心10 min，吸取上層血漿于-20 ℃保存待測。

2.3.4 血漿樣品的處理與測定

精密吸取血漿樣品100 μL置于4 mL EP管中，加入DTX內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋1 min混勻。加入甲基叔丁基醚2 mL渦旋10 min進(jìn)行液液萃取，4 000 r?min-1離心10 min，移取上清液1.8 mL置于另一4 mL EP管中，40 ℃下空氣吹干。殘?jiān)尤胍译?00 μL，渦旋5 min對(duì)其進(jìn)行復(fù)溶，于1.2×104r?min-1離心，吸取上清液進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為5 μL。

2.3.5 血漿樣品的色譜圖

拉洛他賽自乳化制劑和溶液劑分別給藥后的血漿樣品按“2.3.4”條操作，進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖。其中一個(gè)典型色譜圖如圖8所示。

A—LTX; B—DTX; C—LTX and DTX

由圖8可見，拉洛他賽的保留時(shí)間為2.00 min，內(nèi)標(biāo)多西他賽的保留時(shí)間為1.60 min，兩者峰形良好，分離度較好。

2.3.6 血藥濃度曲線

口服拉洛他賽自乳化制劑和溶液劑后，UPLC-MS-MS所測得的血藥-質(zhì)量濃度時(shí)間曲線如圖9所示。

?—LTX-Sol.po;?—LTX-SEDDS.po

2.3.7 血藥濃度數(shù)據(jù)分析

采用DAS 2軟件，將不同時(shí)間內(nèi)血漿質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行擬合，并計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表6。

Table 6 Pharmacokinetic parameters of LTX-SEDDS (oral，40 mg?kg-1) and LTX-Sol (oral，40 mg?kg-1)

由圖9和表6的數(shù)據(jù)可知，口服拉洛他賽溶液劑和自乳化制劑后，溶液劑在0.7 h達(dá)到最大質(zhì)量濃度176.208 μg?L-1，而拉洛他賽自乳化制劑組則延長至3.6 h達(dá)到max（386.322 μg?L-1），這一結(jié)果從圖9的藥時(shí)曲線能更直觀的看出，且拉洛他賽自乳化制劑組具有更小的分布體積和清除率；能有效的延長體內(nèi)的平均滯留時(shí)間（MRT=4.998 h），這可能是由于單油酸甘油酯的加入，使自乳化制劑能黏附在腸壁上，緩慢的發(fā)揮療效；與溶液劑相比，拉洛他賽自乳化制劑的AUC值更高，約為溶液劑組的4.7倍，這也反映出制劑組的相對(duì)生物利用度是溶液劑的5倍之多，藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的具有黏附性的自乳化制劑與溶液劑相比，可以明顯提高抗癌藥物拉洛他賽的口服生物利用度。

3 討論

a. 通常自乳化釋藥體系由油相、乳化劑、助乳化劑以及水相構(gòu)成，油相是影響自微乳形成的重要因素。本實(shí)驗(yàn)在油相的選擇中，一是考慮到拉洛他賽在三辛酸甘油酯的溶解度很大，二是三辛酸甘油酯的黏度較小，因?yàn)楫?dāng)油相的黏度越小，乳化過程就變得越容易，且形成乳劑的粒徑也會(huì)相對(duì)較小，穩(wěn)定性也會(huì)更高?？紤]到載藥量和穩(wěn)定性選擇三辛酸甘油脂作為油相。而單油酸甘油酯中藥物雖然溶解度不是很大，但是由于單油酸甘油酯具有腸道黏膜的黏附作用[8]，有利于增加藥物的吸收，提高生物利用度，所以聯(lián)合使用作為油相。

b. 乳化劑是自微乳粒徑大小的影響因素，乳化劑常選擇毒性較小的非離子型表面活性劑，比如吐溫80，具有良好的HLB值，能使油相迅速乳化，且具有抑制P-gp外排藥物的作用[9]，增加藥物吸收。

c. 在處方篩選過程中采用的是大多數(shù)自乳化制劑常用的目測法，可能存在主觀性，但是可以對(duì)處方進(jìn)行初步的篩選，接著又進(jìn)行了處方優(yōu)化，采用的是均勻設(shè)計(jì)方法，在相應(yīng)的輔料范圍內(nèi)設(shè)計(jì)得到幾個(gè)處方，并以粒徑、自乳化后的穩(wěn)定性以及自乳化時(shí)間為三個(gè)考察指標(biāo)。選擇均勻設(shè)計(jì)表只是用來設(shè)計(jì)處方，并不是用來篩選得到最優(yōu)處方，因此并沒有進(jìn)行回歸分析，并且制劑的穩(wěn)定性和自乳化時(shí)間對(duì)輔料無法進(jìn)行回歸分析。因此最終還是以粒徑、穩(wěn)定性和自乳化時(shí)間為主要篩選指標(biāo)。

d. 微乳進(jìn)入胃腸道后遇水會(huì)自發(fā)形成水包油型的微乳。實(shí)驗(yàn)中自微乳的粒徑為169.7 nm，粒徑較常見的自微乳偏大，其原因可能是因?yàn)槿鄙倭酥榛瘎驗(yàn)橹榛瘎┑闹饕饔檬谴龠M(jìn)乳化劑對(duì)制劑的分散作用[10]。但是助乳化劑也會(huì)帶來問題，比如會(huì)與承載自微乳的硬膠囊殼發(fā)生相互作用從而引起硬膠囊殼脆性變大或者變軟，造成藥物成分可能會(huì)透過膠囊殼而發(fā)生滲漏，而助乳化劑的損失也會(huì)導(dǎo)致制劑對(duì)藥物的增溶作用減弱，難溶性藥物會(huì)析出產(chǎn)生沉淀[11]，其次助乳化劑為親水性物質(zhì)，可能會(huì)與制劑中脂溶性成分產(chǎn)生相溶性問題，從而導(dǎo)致制劑的不穩(wěn)定，例如儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生了分層的現(xiàn)象。所以本實(shí)驗(yàn)未采用助乳化劑，雖然粒徑偏大，但是制劑仍舊是均一穩(wěn)定的溶液。

e. 多數(shù)文獻(xiàn)采用目測法來觀察自乳化體系在溶劑中完全分散形成乳劑所需的時(shí)間，即自乳化時(shí)間，但是主觀上存在較大的差異，評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確度不夠統(tǒng)一，且形成微乳的方式也會(huì)有所不同，本實(shí)驗(yàn)中采用的是自乳化速率來評(píng)價(jià)自微乳的乳化時(shí)間，可以不受分散介質(zhì)的影響，模擬胃腸蠕動(dòng)的條件（37 ℃，50 r·min-1的溫和攪拌），會(huì)更接近制劑進(jìn)入體內(nèi)自乳化的真實(shí)情況，采用透光率的相對(duì)百分率去測定乳化時(shí)間，測定結(jié)果也會(huì)更加準(zhǔn)確。LTX-SEDDS自乳化時(shí)間的延長，與未加入助乳化劑有著密切的關(guān)系，盡管粒徑偏大，自乳化時(shí)間偏長，但是制劑最終是穩(wěn)定、均一的自微乳體系[12]。

f. 常認(rèn)為電位絕對(duì)值在20～40 mV時(shí)，體系會(huì)穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)zeta電位測定結(jié)果顯示，LTX-SEDDS自乳化后的zeta電位為（?24.2 ± 1.22）mV，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)也證明具有較好的穩(wěn)定性。

g. SEDDS經(jīng)口服后，胃腸液不斷增多使自微乳在胃腸道中不斷被稀釋，其中乳化劑的濃度也持續(xù)降低，可能會(huì)影響微乳界面膜的穩(wěn)定性，因此有必要考察不同分散介質(zhì)以及不同稀釋倍數(shù)對(duì)SEDDS穩(wěn)定性的影響，對(duì)研究SEDDS進(jìn)入體內(nèi)后能否保持良好的微乳狀態(tài)具有重要意義。LTX-SEDDS體內(nèi)自乳化后的穩(wěn)定性不受稀釋介質(zhì)和稀釋體積的影響，因此可以預(yù)測LTX-SEDDS在胃腸道中自乳化不受胃腸道體液影響，且在胃腸道被體液大量稀釋后，穩(wěn)定性仍舊良好，使LTX被胃腸道吸收前都以乳劑狀態(tài)存在，有利于提高LTX的口服生物利用度[13]。

4 結(jié)論

作者所制備的拉洛他賽自乳化釋藥系統(tǒng)，易于制備，得到的自乳化制劑粒徑分布均勻，制劑穩(wěn)定，可顯著的提高拉洛他賽的口服生物利用度，為其他口服難溶性的化療藥物生物利用度的提高提供一種新的思路。

[1]TENG F, YANG H , LI G , et al. Parenteral formulation of larotaxel lipid microsphere tackling poor solubility and chemical instability[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2014, 460(1/2): 212-219.

[2]GUPTA M, CHASHOO G, SHARMA P R, et al. Dual targeted polymeric nanoparticles based on tumor endothelium and tumor cells for enhanced antitumor drug delivery[J]. Mol Pharm, 2014, 11(3): 697-715.

[3]KIM S Y, LEE Y M. Taxol-loaded block copolymer nanospheres composed of methoxy poly(ethylene glycol) and poly(epsilon-caprolactone) as novel anticancer drug carriers[J]. Biomaterials, 2001, 22(13): 1697-1704.

[4]王鈺樂,張永萍. 自乳化釋藥系統(tǒng)及其在難溶性中藥成分中的應(yīng)用[J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2016, 38(2): 1002- 1108.

[5]周麗娟, 陳曦, 劉清飛. 紫杉醇自微乳釋藥系統(tǒng)的制備及評(píng)價(jià)[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2014, 49(6): 485-489.

[6]王嬌, 李葆林, 何曉明.新型自乳化給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2016, 33(1): 119-121.

[7]KHOO S M, HUMBERSTONE A J, PORTER C J H, et al. Formulation design and bioavailability assessment of lipidic self-emulsifying formulations of halofantrine[J]. International Journal of Pharmaceutics (Amsterdam), 1998, 167(1/2): 155-164.

[8]HONG J W, LEE I H, KWAK Y H, et al. Efficacy and tissue distribution of DHP107, an oral paclitaxel formulation[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2007, 6(12Pt 1): 3239-3247.

[9]崔升淼, 葉珍珍, 張建. 藥用輔料抑制P-糖蛋白外排泵的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2012, 43(9): 785- 789.

[10]POUTON C W, PORTER C J H. Formulation of lipid-based delivery systems for oral administration: Materials, methods and strategies[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60(6): 625-637.

[11]COLE E T, CADé D, BENAMEUR H. Challenges and opportunities in the encapsulation of liquid and semi-solid formulations into capsules for oral administration[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60(6): 747-756.

[12]陳莉, 周鑫, 申登峰.綠原酸自微乳給藥系統(tǒng)的處方設(shè)計(jì)與體外評(píng)價(jià)[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 38(4): 387- 391.

[13] BADR B, MOHAMED A L, JOHANNE S. Self-emulsifying drugdelivery system developed by the HLB-RSM approach: Characterization by transmission electron microscopy and pharmacokinetic study[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2015, 487(1/2): 56-63.

Preparation and evaluation of larotaxel self-emulsifying drug delivery system and pharmacokinetic study in rats

JIANG Shan，ZHOU Lingli，TANG Xing，ZHANG Yu*

(,,110016,)

To develop a self-emulsifying drug delivery system of larotaxel and to investigate its pharmacokinetics in rats.The solubility of larotaxel in different oil phases and emulsifiers was determined and an intestinal mucoadhesive monoglyceride was added to increase the oral absorption. The final formulations for larotaxel self-emulsifying drug delivery system were optimized based on the pseudo-ternary phase diagrams. The appearance, particle size, potential, self-emulsification time, drug content and stability of the self-emulsifying preparation were investigated, and the bioavailability of solution and self-emulsifying formulation of larotaxel were compared.A homogeneously stable self-emulsifying formulation of larotaxel was prepared with tricaprylin- monoolein-Tween 80 (∶∶= 15∶55∶30). No drug precipitation was observed under polarized light microscopy. The stability of the LTX-SEDDS did not significantly change after being diluted by simulated gastric fluid of pH 1.2, distilled water and simulated intestinal fluid of pH 6.8. The preparation is a slightly opalescent solution with bluish color. The particle size was (169.7 ± 15.36) nm (=3) with the polydispersity index (PDI) of 0.169. The zeta potential was (-24.2 ± 1.23) mV(=3), and the drug content was (0.987 ± 0.018 3)% (=3); The bioavailability of self-emulsified formulation was increased by 4.7 times compared to that of solution group.The self-emulsifying drug delivery system of larotaxel is easy to prepare and shows excellent storage stability. The oral bioavailability of larotaxel increases significantly, which provides a thought for the development of new formulations of oral larotaxel.

pharmaceutics; self-emulsifying drug release system; pseudo-ternary phase diagram; larotaxel; preparation; quality evaluation; bioavailability

R 94

A

（2020）01–0001–14

10.14146/j.cnki.cjp.2020.01.001

2019-04-21

姜珊(1993-), 女(漢族), 河南鄭州人, 碩士研究生, E-mail 1075807496@qq.com;

張宇(1982-), 男(漢族), 吉林四平人, 副教授, 博士,碩士生導(dǎo)師, 主要從事藥劑學(xué)方面的研究, Tel. 024-43520558, E-mail zywinner01@163.com。

（本篇責(zé)任編輯：趙桂芝）