益生元對藏靈菇發(fā)酵乳細菌多樣性和胞外多糖產量的影響

楊銘，郭婷，杜鴻宇，張弛，楊貞耐，朱宏，張健

（1.北京工商大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048；2.北京工商大學食品添加劑工程技術研究中心，北京100048；3.北京工商大學食品質量與安全北京實驗室，北京100048；4.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊050221）

0引言

藏靈菇，是由乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等多種微生物形成的共生體系[1]，是開菲爾傳統(tǒng)乳制品發(fā)酵劑的優(yōu)質來源[2]。胞外多糖是藏靈菇的主要活性代謝產物之一，對于藏靈菇顆粒的生長，發(fā)酵乳質構的形成，腸道遞送過程中微生物活性的保護具有重要作用[3]，研究發(fā)現(xiàn)藏靈菇胞外多糖具有消炎、抑菌、抗氧化、免疫和腸道菌群調節(jié)等多種生物活性[4]，是食品功能因子和醫(yī)藥生物材料的研究熱點之一[5]。但藏靈菇胞外多糖產量較低限制了其開發(fā)和應用[6]。

益生元是一類能夠選擇性改變微生物群落組成和結構的物質[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)益生元通過改變發(fā)酵食品中微生物的組成和豐度增加胞外多糖產量，在發(fā)酵豆乳中加入益生元后戊糖片球菌的活性升高、胞外多糖產量增加了3-4倍[8]。添加乳果糖后酸奶中保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)增加了2.2 logcfu/mL，黏度顯著增加[9]。這與傳統(tǒng)的改變碳源調控菌株的糖代謝通路不同，益生元更多的是通過改變微生物群落的構成影響菌株胞外多糖的產量[10]。

實驗室前期研究確定了培養(yǎng)溫度、底物濃度、接種量、發(fā)酵時間等對藏靈菇胞外多糖產量的影響[11]，明確了藏靈菇胞外多糖的理化和加工特性[12]。本研究將XOS、GOS、Inulin和FOS等常見的寡糖和多糖益生元作為碳源培養(yǎng)藏靈菇。考察益生元對藏靈菇微生物組成、豐度，胞外多糖產量和發(fā)酵特性的影響，以期提高藏靈菇胞外多糖的產量，提升藏靈菇發(fā)酵乳的品質和功能性。

1材料與方法

1.1材料與試劑

藏靈菇，采集自西藏林芝牧戶（NCBI accession number，PRJNA513828）；脫脂乳粉，新西蘭恒天然乳業(yè)集團；低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚果糖，美國Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司；離子交換柱填料DEAE-Sepharose Fast Flow英國Waterman公司；Sepharose CL-6B層析柱填料，瑞典Amersham Bioscience公司；透析袋（8 000～14 000 D），北京鼎國生物技術有限公司。

CR 21GⅢ立式高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；U 3900紫外分光光度計，日本HITACHI公司；S20數(shù)顯pH計，梅特利-托利多儀器有限公司；DV-III Ultra黏度計，美國Brookfield公司；THZ-D電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒儀器科技有限公司；DNA提取試劑盒，德國Qiagen公司；2.5L厭氧培養(yǎng)盒，日本三菱化學公司。

1.2實驗方法

1.2.1酸奶的制備和益生元的添加

以115℃滅菌15 min后的脫脂乳為基質，按5%的比例將活化好的藏靈菇接種到每組滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，再向各組乳中分別添加1.5%XOS、1.5%GOS、1.5%Inulin、1.5%FOS，于37℃分別在有氧及無氧條件下發(fā)酵酸奶。（有氧條件為用除菌膜封口在空氣狀態(tài)下培養(yǎng)，其中氧氣濃度約為21%；無氧條件是使用厭氧培養(yǎng)盒培養(yǎng)）

1.2.2 p H值的測定

采用p H計直接測定的方法。

1.2.3黏度的測定

用旋轉式黏度計直接測定，參數(shù)設置參考曹永強等[13]的研究方法。使用LV34轉子，轉速為5 r/min，采樣點間隔5 s，掃描時間2 min。每個樣品平行測定三次，取平均值。

1.2.4胞外多糖的提取及含量的測定

胞外多糖的提取參考曹永強等[14]的方法，將活化好的藏靈菇按3%（v/v）的接種量接種到脫脂乳培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24 h。向發(fā)酵液中加入80%（m/v）的三氯乙酸(TCA)溶液至終濃度為4%(m/v)，室溫下攪拌2 h，10 000×g 4℃離心45 min，去除細胞和蛋白。取上清液并加入兩倍體積的無水乙醇（95%），于4℃冷藏靜置12 h，10 000×g 4℃離心45 min。沉淀用蒸餾水溶解，裝入分子截流量為8 000～14 000 Da的透析袋中透析48 h，每8 h換一次蒸餾水。再經濃縮、冷凍干燥制得粗多糖。使用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱和Sepharose CL-6B凝膠柱對粗多糖層析純化。

1.2.5菌群組成和豐度的測定

參考郝曉娜[15]的16SrRNA測定菌群組成多樣性的方法，采用試劑盒QIAamp DNA Stool Mini Kit提取酸奶樣品中的總DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量分析。對稀釋后的DNA基因組使用Q5高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，PCR擴增產物交由美吉生物公司進行測序和序列數(shù)據(jù)整理，組成和豐度數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析由實驗室自己完成。

1.2.6菌群豐度影響的關聯(lián)分析

菌群種類作為變量，添加益生元的種類和通氧量作為環(huán)境因素，每個在有氧或無氧條件下添加益生元的發(fā)酵乳作為樣本。采用CANOCO 4.5統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，p＜0.05表示差異顯著，p＞0.05表示差異不顯著。應用CANOCO 4.5統(tǒng)計分析軟件對發(fā)酵乳中菌群進行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2結果與分析

2.1益生元對藏靈菇胞外多糖產量的影響

為了考察XOS，GOS，Inulin和FOS 4種益生元對藏靈菇胞外多糖產量的影響，研究分別將4種益生元加入藏靈菇發(fā)酵乳中，在有氧和無氧條件下發(fā)酵48 h后，檢測發(fā)酵乳中胞外多糖含量。結果如圖1所示，4種益生元均能夠顯著增加藏靈菇胞外多糖的產量（P＜0.05），大小依次為XOS＞GOS＞FOS＞Inulin。氧氣對藏靈菇胞外多糖的產量也存在較大影響，且對不同益生元組藏靈菇胞外多糖的影響不同。綜合來看，無氧條件下XOS的產量最高達2117.55 mg/L，是對照組（未添加益生元）的16.9倍，也高于實驗室之前的報道的藏靈菇胞外多糖產量[11]。GOS組和FOS組有氧發(fā)酵的胞外多糖產量高于無氧發(fā)酵，Inulin組在有氧和無氧條件下的胞外多糖產量差異不顯著（P＞0.05）。表明不同益生元對藏靈菇胞外多糖產量的影響與是否厭氧發(fā)酵有關，這可能是藏靈菇中需氧菌和厭氧菌在有氧和無氧條件下益生元代謝發(fā)生了變化。

圖1益生元對藏靈菇胞外多糖產量的影響

2.2益生元對藏靈菇發(fā)酵乳細菌組成的影響

益生元是現(xiàn)代菌群微生態(tài)調節(jié)的重要功能因子[16]。為明確在有氧和無氧條件下，益生元對藏靈菇微生物組成的影響，采用宏基因組學方法，針對細菌基因組16s DNA V3-V4區(qū)，研究了4種益生元對藏靈菇細菌組成和豐度的影響。結果如圖3所示，藏靈菇中共鑒定出細菌12屬（個別鑒定到種），與國內外報道的一些藏靈菇和開菲爾的細菌種屬一致[17-19]。4種益生元對藏靈菇的12個屬的細菌均表現(xiàn)出調節(jié)能力，調節(jié)后組間豐度最大差異（△A，△A=Abundancemax-Abundancemin）較高的屬包括Lactobacillus sp.(△A=44%)，Leuconostoc sp.（△A=23%），Lactococcus sp.（△A=13%），Weissella sp.（△A=10%）和Streptococcus sp.（△A=9%）。采用無氧培養(yǎng)時，4個益生元組的細菌種類減少為9個屬，Acetobacter sp.、Shewanella sp.和Pseudomonas sp.菌無法檢出。無氧和有氧條件下受益生元影響較大的菌群有，XOS組無氧條件下最高菌群為Lactobacillus bulgaricus豐度57%，有氧條件下Lactobacillus bulgaricus下降-25%，Weissella sp.和Acetobacter sp.屬菌群豐度比無氧條件增加+20%和+9%，推測XOS組厭氧條件下胞外多糖產量高可能這些菌的豐度變化有關。其它益生元組菌群豐度變化相對較小，無氧和有氧條件相比GOS組Shewanella sp.（+11%），Pseudomonas sp.（-10%）豐度變化較大；Inulin組Lactobacillus sp.（-15%）和Acetobacter sp.（+12%）豐度變化較大；FOS組Lactobacillus sp.（-7%）、Lactobacilluskefiri（+10%）、Leuconostoc sp.（+15%）和Shewanella sp.（+14%）豐度變化較大。

圖3益生元對藏靈菇發(fā)酵乳細菌多樣性的影響

2.3益生元對藏靈菇菌群組成影響的冗余分析

圖4菌群豐度與影響因素的冗余分析

為了進一步明確益生元的種類和氧氣對于藏靈菇發(fā)酵乳中的微生物多樣性的影響，對發(fā)酵乳中微生物多樣性與益生元、氧氣進行了冗余分析（RDA）。首先對樣品數(shù)據(jù)進行去趨勢對應分析，分析結果顯示樣本梯度長度最大值為1.279。根據(jù)Smilauer[20]等的方法,當梯度長度最大值小于3時，適于線性模型RDA線性模型法分析。結果如圖4所示，圖中箭頭代表對發(fā)酵乳不同的影響因素，其方向代表該因素對發(fā)酵乳中微生物多樣性影響的取向，長短代表對微生物種類影響的大小。橫縱坐標分別代表各排序軸對物種數(shù)據(jù)的解釋量。在有氧的情況下，Acetobacter sp.、Leuconostoc sp.、Shewanella sp.、Lactococcus sp.、Lactobacillus kefiri生長較好，這可能與它們的需氧和微需氧特性有關，氧氣和益生元促進了其增殖[21]。而其余的六個菌屬可能更適合在無氧的條件下協(xié)同生長。同時可以看出，在氧氣和XOS的共同作用下，藏靈菇發(fā)酵乳中醋酸桿菌和明串珠菌的生長情況顯著優(yōu)于在無氧情況下生長情況，這與菌群豐度的定量分析結果一致，結合胞外多糖產量的數(shù)據(jù)可推測這兩種菌株可在有氧條件下產生大量的胞外多糖，而無氧的條件更適合保加利亞乳桿菌生長并代謝產生大量胞外多糖，實驗室也利用純培養(yǎng)方法在XOS培養(yǎng)的藏靈菇中分離出了一株產胞外多糖的保加利亞乳桿菌KW14-3。此外，僅考慮益生元對藏靈菇菌群多樣性的影響，F(xiàn)OS對藏靈菇中Shewanella sp.、Lactobacillus kefiranofaciens和Lactococcus sp.生長促進作用較強；Inulin對Lactobacillus kefiri、Dysgonomonas sp.和Shewanella sp.的生長促進作用較強；GOS對Pseudomonas sp.、Lactobacillus sp.和Streptococcus sp.生長促進作用較強。

無論是在有氧還是無氧的條件下，RDA分析圖中益生元射線的指向和長度表明，XOS對藏靈菇發(fā)酵乳菌群的調節(jié)作用與GOS、Inulin和FOS的調節(jié)作用有較大差異，后三種益生元對于菌群的調節(jié)作用較為接近。這可能是加入XOS的發(fā)酵乳中胞外多糖產量顯著高于其他三組的原因。

2.4益生元對藏靈菇發(fā)酵乳p H和黏度的影響

圖5無氧條件下發(fā)酵益生元對藏靈菇發(fā)酵乳黏度的影響

鑒于無氧發(fā)酵藏靈菇的胞外多糖產量最高，實驗考察了無氧條件下益生元對藏靈菇發(fā)酵乳p H和黏度的影響，結果如圖5所示，添加了4種益生元的發(fā)酵乳的pH值均隨時間的延長而下降，對4條曲線進行線性擬合，斜率（k）為最大p H下降速度，則k XOS=-0.042，k GOS=-0.0418，k Inulin=-0.0524，k FOS=-0.0487和k Control=-0.0597可知添加益生元后藏靈菇發(fā)酵乳的pH下降速率變慢，發(fā)酵終點的pH值低于未添加組。蔣萌蒙等[22]在添加木糖醇、菊粉、低聚果糖、低聚麥芽糖4種益生元對酸乳的影響的研究中也得到了相似的結論，即益生元的添加有利于酸奶的發(fā)酵及p H值的下降。益生元中Inulin的pH下降速度最快，Inulin的趨勢與已報道的結論相同，另外3種益生元的趨勢與Farinha等人[23]的結果不一致，這可能是由于本實驗中的厭氧條件和培養(yǎng)基組成差異造成的。發(fā)酵終點添加了FOS的發(fā)酵乳的pH值最低，為4.10。但各組樣品的最終pH差異并不顯著（P＞0.05）。

發(fā)酵乳的黏度是評價其感官性狀的重要指標，益生元的添加可提高發(fā)酵乳的黏度賦予發(fā)酵乳粘稠濃厚的口感[24]。由圖5可知，在有氧發(fā)酵條件下，添加了不同種益生元對發(fā)酵乳的黏度產生了顯著影響（P＞0.05），其中添加了XOS的發(fā)酵乳的黏度最高為2038 cp，這與XOS組胞外多糖產量最高結果相一致，胞外多糖能夠提高發(fā)酵乳的黏度和結構穩(wěn)定性[25]。添加了Inulin的發(fā)酵乳的黏度最低為1077 cp，但與對照組相比，添加益生元均能有效改善藏靈菇發(fā)酵乳的黏度特性。

3結論

益生元是現(xiàn)代菌群微生態(tài)調節(jié)的重要功能因子。以往的研究多集中于益生元對腸道菌群的影響，而對發(fā)酵乳中菌群調節(jié)作用的研究較少。實驗比較了XOS、GOS、Inulin和FOS 4種益生元對藏靈菇菌群和胞外多糖的產量影響。無氧條件下XOS會促進藏靈菇中Lactobacillus bulgaricus菌株增殖為優(yōu)勢菌群（豐度57%），降低Weissella sp.（-20%）和Acetobacter sp.（-9%）菌群豐度，使得藏靈菇發(fā)酵乳中的產量達2117.55 mg/L，是對照組（未添加益生元）的16.9倍。GOS、Inulin和FOS有氧發(fā)酵條件下，也分別通過對藏靈菇菌群豐度的調節(jié)（Shewanella sp.、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactococcus sp.、Lactobacillus kefiri、Dysgonomonas sp.、Pseudomonas sp.、Lactobacillus sp.和Streptococcus sp.）使藏靈菇胞外多糖的產量分別增加了11.62倍、2.52倍和10.06倍。對藏靈菇發(fā)酵乳的pH和黏度分析顯示，添加益生元減慢了pH下降速度，但降低了發(fā)酵終點的p H值。添加XOS、GOS、Inulin和FOS 4種益生元發(fā)酵乳的黏度分別增加2.48倍、1.51倍、1.31倍和1.54倍。研究表明XOS、GOS、Inulin和FOS益生元能夠通過改變藏靈菇的菌群構成，增加藏靈菇胞外多糖產量，改善藏靈菇發(fā)酵乳的品質。本研究為應用益生元改善天然復合發(fā)酵劑菌株構成，提高發(fā)酵乳品質提供理論依據(jù)。