酶解-分光光度法測定乳粉中L-色氨酸含量

田洪蕓，王文特，王冠群，張海紅，提靖靚

（山東省食品藥品檢驗研究院山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，濟南250101）

0引言

L-色氨酸是人體必需的8種必需氨基酸之一，只能通過食物來攝取，人體日常飲食中缺乏L-色氨酸會出現(xiàn)與蛋白質(zhì)缺乏癥類似的癥狀。此外，L-色氨酸能促進大腦神經(jīng)細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺，可緩解人體緊張情緒，改善人體睡眠，乳粉屬于L-色氨酸含量較為豐富的食物之一[1-4]。

L-色氨酸易溶于水或乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀堿中較穩(wěn)定。目前，我國還沒有針對乳粉中L-色氨酸測定的方法標準，GB 5009.124-2016《食品安國國家標準食品中氨基酸的測定》標準采用酸水解樣品，不適用于L-色氨酸的測定；國內(nèi)外測定標準方法主要有分光光度法、電位滴定法和液相色譜法，其中分光光度法和液相色譜法是測定L-色氨酸的常用方法，上述方法均采用堿水解法處理樣品，但堿水解條件會導(dǎo)致乳粉中L-色氨酸的降解，不適用于乳粉檢測[5-11]。AOAC標準草案使用酶解法測定嬰幼兒配方乳粉中L-色氨酸[12]。本文參照AOAC標準L-色氨酸測定的酶解法前處理方法，建立了采用紫外可見分光光度計測定乳粉中L-色氨酸的方法，經(jīng)驗證，方法的穩(wěn)定性好、準確度高。

1原理

試樣經(jīng)蛋白酶酶解，在強酸性介質(zhì)中，氧化劑存在下，L-色氨酸的吲哚環(huán)與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成藍色化合物，在一定范圍內(nèi)藍色化合物的吸光度值與L-色氨酸含量成正比，用標準曲線定量。

2試劑和材料

2.1試劑和材料

市售全脂乳粉、標準乳粉1849a（NIST）；灰色鏈霉菌蛋白酶，XIV型,活力≥3.5 U/mg，德國西格瑪；甲醇，色譜純，國藥試劑；乙酸，國藥試劑；鹽酸，國藥試劑；Tris堿C 4H 11NO 3，國藥試劑；濃硫酸，國藥試劑；亞硝酸鈉，國藥試劑；對二甲氨基苯甲醛，國藥試劑；L-色氨酸標準品（CAS號：73-22-3）；電子分析天平，日本島津；紫外分光光度計，日本島津；p H計，梅特勒；恒溫培養(yǎng)箱，伯輝；離心機，轉(zhuǎn)速≥9 000 r/min，德國賀默。

2.2試劑配制

2.2.1 Tris緩沖液（0.1 mol/L，pH=8.5）

稱取6.0 g Tris堿于500 mL燒杯中，加水300 mL溶解，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液的p H到8.5±0.05，將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，水定容至刻度，混勻。

2.2.2蛋白酶溶液（5 mg/mL）

稱量一定質(zhì)量的蛋白酶，用Tris緩沖液稀釋并定容，使蛋白酶濃度為5 mg/mL。注意不要搖動，避免起泡。臨用現(xiàn)配，室溫下6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3硫酸溶液（21.2 mol/L）

量取589 mL硫酸，緩慢加入約350 mL水中，冷卻后用水稀釋至1 L。

2.2.4對二甲氨基苯甲醛溶液（1%）

稱取1.00 g對二甲氨基苯甲醛用硫酸溶液溶解并定容至100 mL，臨用時現(xiàn)配。

2.2.5亞硝酸鈉溶液（0.2%）

稱取0.10 g亞硝酸鈉，溶解于50 mL水中，臨用時現(xiàn)配。

2.3標準溶液的配制

2.3.1 L-色氨酸標準儲備液（100μg/mL）

稱取25 mg色氨酸標準品（精確到0.1 mg），用水充分溶解，定容至250 mL，貯存于4℃冰箱中保存，有效期1個月。

2.3.2 L-色氨酸標準系列溶液

準確移取色氨酸標準儲備液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用水溶解至刻度，該標準系列濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、50μg/mL。

3實驗過程

3.1試樣處理

稱取試樣0.2 g（精確到0.1 mg），置于50 mL離心管中，依次加入2 mLTris緩沖溶液、0.5 mL蛋白酶溶液、0.2 mL甲醇，置于旋渦混合器上混合至試樣全部溶解，并盡量減少試樣溶液掛壁。將混合后的試樣溶液置于50℃的恒溫培養(yǎng)箱中酶解16 h。同時做空白試驗。將盛有水解液的離心管取出，冷卻至室溫，加入12 mL甲醇，全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。取出約15 mL置于15 mL離心管中，以8 000 r/min～10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min～10 min，取離心后澄清液過0.22μm有機相尼龍濾膜，濾液備用。

3.2測定

分別移取2.00 mL試樣濾液及標準系列溶液置于10 mL比色管中，分別加入5.00 mL對二甲氨基苯甲醛溶液，混勻，靜置20 min后加入0.2 mL亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置25 min。同時做試劑空白。

以試劑空白調(diào)零，在590 nm波長處測定吸光度值，以L-色氨酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

圖1色氨酸測定標準曲線

3.3結(jié)果計算

試樣中色氨酸的含量按式（1）計算：

式中：

X為試樣中L-色氨酸的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；c為由標準曲線得到的試樣測定液中L-色氨酸的含量，單位為微克（μg）；C 0為由標準曲線得到的空白試驗測定液中L-色氨酸的含量，單位為微克（μg）；m為試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V 1為試樣液定容體積（mL）；V 2為顯色時試樣液移取體積（mL）。

3.4酶解條件的確立

3.4.1正交試驗

參照AOAC標準規(guī)定的酶解條件以及蛋白酶的反應(yīng)條件，設(shè)計了3因素（酶解時間、溫度，酶的用量）3水平的正交試驗，酶解時間考察14、16、18 h3個水平；酶解溫度考察40、50、60℃3個水平；酶的用量考察250、500、1000μL 3個水平，結(jié)果詳見表1。結(jié)果表明，正交試驗結(jié)果最滿意的為5號樣品，酶解條件為酶的用量為1000μL，酶解溫度為50℃，酶解時間為16 h。

表1正交試驗結(jié)果

根據(jù)正交試驗的結(jié)果，以1849a乳粉質(zhì)控樣（L-色氨酸含量為184±10 mg/100g）為實驗樣品，確定最佳酶解時間、溫度和酶用量。

（1）酶解溫度

酶的用量設(shè)定為1000μL，時間設(shè)定為16 h，考察40、45、50、55、60℃等不同溫度下的測定結(jié)果，結(jié)果表明，當酶解溫度為50℃時，樣品達到酶解峰值，結(jié)果見圖2。

圖2在不同酶解溫度下的測定結(jié)果

（2）酶解時間

酶的用量設(shè)定為1000μL，溫度設(shè)定為50℃，分別考察不同酶解時間（14、16、18、20、22、24 h）的測定結(jié)果。試驗表明，當酶解的時間超過16 h以后，結(jié)果趨于穩(wěn)定，證明酶解充分。推薦的酶解時間為16 h，也可根據(jù)具體樣品調(diào)節(jié)酶解時間，結(jié)果見圖3。

圖3在不同酶解時間下的測定結(jié)果

（3）酶的用量

酶解時間設(shè)定為16 h，溫度設(shè)定為50℃，考察酶的用量對結(jié)果的影響。結(jié)果均為扣除試劑空白以后的結(jié)果。試驗表明，當酶的用量超過0.5 mL以后，結(jié)果趨于穩(wěn)定，說明當酶的用量為0.5 mL時，樣品基本酶解完全，綜合考慮到成本等問題，建議采用0.5 mL的酶用量，結(jié)果見圖4。

圖4不同酶用量下的測定結(jié)果

3.5顯色條件的確定

3.5.1最大吸收波長的確立

使用濃度為10、20、30、40、50μg/mL的L-色氨酸標準溶液，按照3.2進行顯色處理，對樣液進行全波長掃描。

圖5不同濃度L-色氨酸標準溶液全波長掃描曲線

由5個濃度梯度標準溶液的全波長掃描結(jié)果可知，顯色液的最大吸收波長確定為590 nm。

3.5.2硫酸溶液濃度的選擇

選取濃度為30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸標準溶液，考察硫酸溶液濃度變化對吸光度的影響。硫酸濃度分別為9、12、18、21.2 mol/L，吸光度隨硫酸溶液濃度增大而增大，并逐漸趨于穩(wěn)定，最終確定硫酸溶液濃度為21.2 mol/L測定結(jié)果最好，詳見圖6。

圖6硫酸溶液濃度對吸光度影響

3.5.3對二甲氨基苯甲醛濃度

選取濃度為30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸標準溶液，其他反應(yīng)條件不變，改變對二甲氨基苯甲醛濃度，考察其對標準溶液吸光度的影響。吸光度先隨對二甲氨基苯甲醛濃度增大而增大，達到最高點后再緩慢下降。綜合考慮，選擇對二甲氨基苯甲醛的濃度為1%最合適，這與GB/T 15400-2018《飼料中色氨酸的測定》要求一致，見圖7。

圖7對二甲氨基苯甲醛濃度對吸光度影響

3.5.4亞硝酸鈉濃度

選取濃度為30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸標準溶液，其他反應(yīng)條件不變，改變對亞硝酸鈉濃度，考察其對標準溶液吸光度的影響。總體上來說，吸光度是隨亞硝酸鈉濃度增大而緩慢下降的。綜合考慮，認為亞硝酸鈉濃度為0.2%最合適，這與GB/T 15400-2018《飼料中色氨酸的測定》要求一致，見圖8。

表2準確度實驗表

圖8亞硝酸鈉濃度對吸光度影響

3.5.5反應(yīng)時間

顯色反應(yīng)涉及到兩步反應(yīng)，固定亞硝酸鈉反應(yīng)時間25 min，考察了30μg/mL標準溶液吸光度隨對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時間的變化。吸光度隨反應(yīng)時間增長，先增大后趨于穩(wěn)定不變。因此選擇對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時間為20 min，詳見圖9。

圖9對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時間對吸光度影響

固定對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時間20 min，考察30μg/mL標準溶液吸光度隨亞硝酸鈉反應(yīng)時間的變化。吸光度隨反應(yīng)時間增長基本沒有變化?？紤]到為使反應(yīng)充分和與GB/T 15400-1994一致，選擇亞硝酸鈉反應(yīng)時間為25 min，詳見圖10。

4準確度和精密度實驗

4.1準確度實驗

對1849a質(zhì)控樣和全脂乳粉2個樣品，進行3個濃度水平的加標實驗（n=6）,計算回收率和相對標準偏差。

圖10亞硝酸鈉反應(yīng)時間對吸光度影響

L-色氨酸的回收率在97.3%～102.5%之間，質(zhì)控樣及全脂乳粉測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為0.32%～1.72%之間，方法的回收率好，準確度高，完全能夠滿足實際樣品檢測的需求[13]。

4.2精密度實驗

對1849a質(zhì)控樣、全脂乳粉和L-色氨酸營養(yǎng)強化奶粉3種樣品進行精密度（n=6）實驗，計算相對標準偏差。

表3精密度實驗表（n=6）

1849a質(zhì)控樣的測定結(jié)果為179.6～186.5 mg/100g，均在標示的含量范圍內(nèi)（174～184 mg/100g），方法的準確度高。3種樣品測定結(jié)果（n=6）的相對標準偏差RSD為1.2%～2.4%，說明方法的精密度較好[14]。

5結(jié)論

本文參照AOAC標準的酶解前處理方法，建立了一種使用分光光度計測定乳粉中L-色氨酸的檢測方法。經(jīng)驗證，在0.5μg/mL～50μg/mL濃度范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好。采用1849a質(zhì)控樣、全脂乳粉等進行準確度和精密度實驗（n=6），方法的回收率分布在97.3%～102.5%之間，相對標準偏差RSD分布在0.32%～1.72%之間；樣品精密度實驗結(jié)果相對標準偏差在1.2%～2.4%之間，方法的穩(wěn)定性好。