木薯ETR1基因克隆及表達(dá)分析

陳志晟　顏彥　趙思涵　田麗波　商桑　胡偉

摘要：【目的】克隆木薯乙烯受體基因（MeETR1）并檢測其在木薯采后生理性變質(zhì)（PPD）過程中的表達(dá)情況，為研究ETR基因家族在木薯PPD過程中的功能作用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳阅臼砥贩N華南8號為材料，應(yīng)用PCR擴(kuò)增MeETR1基因編碼區(qū)（CDS）序列，采用生物信息學(xué)分析方法對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域及二、三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測分析，通過亞細(xì)胞定位確定MeETR1蛋白在植物細(xì)胞中的表達(dá)分布，并利用實時熒光定量PCR檢測MeETR1基因在木薯采后PPD過程的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】克隆獲得MeETR1基因CDS序列全長2220 bp，共編碼739個氨基酸，蛋白分子量為82.88 kD，理論等電點（pI）為6.76;MeETR1基因編碼蛋白屬于疏水蛋白，含有ETR1家族4個典型模塊，即GAF結(jié)構(gòu)域、HisKA結(jié)構(gòu)域、HATPase_c結(jié)構(gòu)域和REC結(jié)構(gòu)域;其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占47.43%、延伸鏈占14.46%、無規(guī)則卷曲占38.11%。MeETR1氨基酸序列（XP_021625986.1）與同屬大戟科的蓖麻（Ricinus communis）ETR1氨基酸序列（XP_002533252.1）相似性為92.42%，親緣關(guān)系較近;MeETR1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。與0 h（PPD前）相比，MeETR1基因的相對表達(dá)量在木薯采后PPD過程中（12、24、48和96 h）均呈顯著下降趨勢（P<0.05），即MeETR1基因表達(dá)受木薯采后PPD過程的抑制。【結(jié)論】MeETR1基因編碼蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結(jié)構(gòu)域，與其他植物ETR1在生物學(xué)功能上具有一致性;MeETR1基因表達(dá)在木薯采后PPD過程中受抑制，可能在此過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 木薯;乙烯受體（ETR）;MeETR1基因;生理性變質(zhì)（PPD）;表達(dá)分析

中圖分類號： S533.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0019-08

Abstract：【Objective】In this study， the cassava ethylene receptor gene named MeETR1 was cloned and its expression level during the post-harvest physiological deterioration（PPD） process of cassava was detected， which laid a foundation for studying the function of the ETR gene family in cassava PPD process. 【Method】The coding region（CDS） of MeETR1 gene was amplified from cassava variety SC8 by PCR method， and the physicochemical properties， hydrophili-city/hydrophobicity， conserved domains， secondary and tertiary structures， and phylogenetic relationship were analyzed by bioinformatics method. The distribution of MeETR1 protein in plant cells was determined by subcellular localization， and the expression pattern of MeETR1 gene in PPD process was detected by qPCR. 【Result】The CDS of MeETR1 gene was 2220 bp in length and encoded 739 amino acids. The protein molecular weight was 82.88 kD， and the theoretical isoelectric point （pI） was 6.76. MeETR1 gene encoded protein was hydrophobin and contained four typical modules of the ETR1 family， namely GAF domain， HisKA domain， HATPase_c domain and REC domain. In the secondary structure， the α-helix accounted for 47.43%， the extended chain accounted for 14.46%， and the irregular coil accounted for 38.11%. The amino acid sequence of MeETR1 （XP_021625986.1） was 92.42% similar to the amino acid sequence of Ricinus communis ETR1 （XP_002533252.1）， which had the close genetic relationship. Subcellular localization proved that MeETR1 was localized in the cytoplasm. The relative expression level of MeETR1 showed a significant declined trend during PPD process（12， 24， 48 and 96 h）（P<0.05） compared with 0 H（before PPD）， indicating MeETR1 gene was inhibited by cassava PPD process. 【Conclusion】The protein encoded by MeETR1 gene contains four typical domains including GAF， HisKA， HATPase_c and REC， and its biological function is consistent with other plant ETR1. MeETR1 gene is inhibited during the cassava PPD process and might play a negative role in regulating PPD of cassava storage roots.

Key words： cassava; ethylene receptor（ETR）; MeETR1 gene; post-harvest physiological deterioration（PPD）; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31801419）;General Program of Hainan Natural Science Foundation（317036）;Hainan Graduate Student Innovation Research Project（Hys2018-34）

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta）是大戟科木薯屬植物，具有抗旱、耐瘠薄、適應(yīng)性廣及塊根淀粉含量高等特點（張鵬等，2014），但木薯塊根極不耐貯藏，采收后2～3 d即出現(xiàn)嚴(yán)重的生理性變質(zhì)（Post-harvest physiological deterioration，PPD），也就是木薯塊根維管束出現(xiàn)褐變，且隨貯藏時間的延長而不斷加劇（Zidenga et al.，2012;Xu et al.，2013），嚴(yán)重制約了木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。乙烯（Ethylene）是一種氣態(tài)的植物激素，其介導(dǎo)的信號通路在植物生長發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用（Hershkovitz et al.，2009;施怡婷和楊淑華，2016;趙赫等，2016;Ren et al.，2017）。乙烯受體蛋白（ETR）是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵元件之一，在調(diào)控植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫等過程中扮演重要角色（Zhou et al.，2007;Gao and Schaller，2009;Bisson and Groth，2010）。因此，對木薯乙烯受體ETR基因（MeETR）進(jìn)行研究，可為揭示ETR在木薯PPD過程中的作用機制提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】乙烯受體根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)的不同，可分為ETR I家族受體和ETR II家族受體。ETR基因最先從擬南芥中克隆獲得（Gamble et al.，1998），之后相繼從橡膠樹（張桂和，2002）、香蕉（賀立紅等，2009）、水稻（黃溪，2016）和番茄（蘇麗艷，2019）等多種植物中克隆出多個家族成員，并證實了其在調(diào)控植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫中的功能作用。張桂和（2002）發(fā)現(xiàn)不同品種的橡膠樹在經(jīng)乙烯處理后其HbETR1基因表達(dá)呈明顯的增加趨勢，說明橡膠樹對乙烯利刺激的反應(yīng)較敏感;魏紹沖等（2004）研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃AdETR1基因在果實成熟過程中上調(diào)表達(dá)，說明AdETR1基因與果實成熟有關(guān);謝永紅等（2005）研究表明，桃ETR1基因cDNA合成受溫度和赤霉素（GA3）的調(diào)節(jié)，而乙烯的合成能力隨ETR1基因表達(dá)量的上調(diào)而上升，即ETR1基因與乙烯合成有關(guān);賀立紅等（2009）發(fā)現(xiàn)38 ℃熱處理能抑制香蕉MaETR1基因在果皮中的表達(dá)，而低溫處理可促進(jìn)MaETR1基因在果皮中的表達(dá);郝金鳳等（2012）通過分析甜瓜Cm-ETR2基因發(fā)現(xiàn)，Cm-ETR2基因在果實生長過程中的表達(dá)不斷增強，并證實其能延長果實的貯藏時間;李麗秀和賴鐘雄（2013）研究證實枇杷EjETR1a和EjETR2a基因在植株的生長發(fā)育及成熟衰老過程中起調(diào)控作用;黃溪（2016）通過研究水稻OsETR4基因發(fā)現(xiàn)，OsETR4基因在低溫脅迫下其表達(dá)量上升，進(jìn)而增強水稻在發(fā)芽期及苗期的耐冷性;田曉巖等（2017）研究發(fā)現(xiàn)文心蘭時空特異性表達(dá)OnERS1基因與花衰老有關(guān);李麗等（2018）研究表明芒果MiETR1基因參與果實成熟和衰老過程，并證實MiETR1能延長果實的貯藏時間;蘇麗艷（2019）從番茄克隆獲得SlETR6基因，且證實該基因參與番茄生長發(fā)育過程中的逆境調(diào)控。【本研究切入點】上述研究結(jié)果均表明，ETR1基因家族在植物生長發(fā)育及逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，但至今有關(guān)MeETR1基因在木薯采后PPD過程中的作用機制尚無研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以木薯品種華南8號為材料，結(jié)合木薯全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對MeETR1基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并通過實時熒光定量PCR檢測其在木薯采后PPD過程中的相對表達(dá)量，為研究ETR基因家族在木薯PPD過程中的功能作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

木薯品種華南8號由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及pMD18-T載體購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×Taq MasterMix、ChamQ Universal SYBR RT-PCR MasterMix試劑盒及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司，農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scien-tific公司，亞細(xì)胞定位載體pNC-Green-SubN和Nimble Cloning試劑盒購自海南壹田生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：超微量紫外分光光度計（Thermo，美國），PCR儀（耶拿，德國），EPS300電泳儀（Tanon，上海），CT15RT高速冷凍離心機（TECHCOMP，中國），4100凝膠成像儀（Tanon，上海），F(xiàn)luoView FV1000激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本），MX3000熒光定量PCR儀（安捷倫，美國）。

1. 2 材料處理

選取外表皮無破損的木薯塊根，將其切下3～4片直徑在4 cm左右的塊根切片擺放在托盤中，置于溫度26 ℃、相對濕度75%、光周期16 L∶8 D的培養(yǎng)箱中，分別在貯藏0、12、24、48和96 h等時段取出木薯塊根，所有樣品均經(jīng)液氮凍存后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 木薯總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取不同時段的木薯塊根RNA，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并以超微量紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于后續(xù)基因克隆及表達(dá)分析。

1. 4 基因克隆與載體構(gòu)建

結(jié)合木薯全基因組數(shù)據(jù)及本課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)MeETR1基因編碼區(qū)（CDS）序列設(shè)計引物MeETR1-F和MeETR1-R（表1），以木薯塊根cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物（MeETR1-F和MeETR1-R）各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 160 s，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。符合預(yù)期大小的目的片段用DNA回收純化試劑盒進(jìn)行回收純化，然后連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒并保存用于后續(xù)研究。

1. 5 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 6.0對MeETR1基因序列進(jìn)行比對分析，通過EXPASY數(shù)據(jù)庫（http：//web.expasy.org/protparam/）分析其推導(dǎo)氨基酸序列的理化性質(zhì)，以EMBNET數(shù)據(jù)庫分析其跨膜結(jié)構(gòu)，運用CD-Search進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析;分別利用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對其編碼蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析;采用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索及比對分析同源序列，并以MEGA 7.0中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 6 亞細(xì)胞定位

根據(jù)MeETR1基因CDS序列設(shè)計引物（表1），以陽性克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后使用Nimble Cloning MIX試劑將其連接至pNC-Green-SubN表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體pNC-Green-SubN-MeETR1，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)14 h，挑菌、搖菌后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。經(jīng)測序比對分析后，選取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，使用瞬時轉(zhuǎn)化法分別將pNC-Green-SubN-MeETR1和空載pNC-Green-SubN（對照）轉(zhuǎn)入到煙草葉片中。25 ℃培養(yǎng)48 h后選取侵染的葉片制作切片，通過FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號在煙草葉片細(xì)胞中的分布情況。

1. 7 基因表達(dá)分析

以木薯TUB基因為內(nèi)參基因，根據(jù)MeETR1基因CDS序列設(shè)計引物QMeETR1-F和QMeETR1-R（表1），通過實時熒光定量PCR檢測MeETR1基因在木薯采后PPD過程中的表達(dá)情況。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：熒光染料Mix 10.0 μL，正、反向引物（QMeETR1-F和QMeETR1-R）各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。每個樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，使用2-△△Ct法換算MeETR1基因的相對表達(dá)量（顏彥等，2018）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MeETR1基因克隆結(jié)果

以MeETR1-F和MeETR1-R為引物、木薯塊根cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得一條約2000 bp的目的基因條帶（圖1），經(jīng)回收純化、連接至pMD18-T載體及轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑選陽性克隆進(jìn)行測序，證實得到目的基因即為MeETR1基因（cassava4.1_002375m.g），其CDS序列為2220 bp，編碼739個氨基酸。

2. 2 MeETR1蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析結(jié)果

MeETR1蛋白分子量為82.88 kD，理論等電點（pI）為6.76，原子總數(shù)為11819，化學(xué)式為C3727H6001N1003 O1050S38;其氨基酸成分中亮氨酸[Leu（L）]、纈氨酸[Val（V）]和丙氨酸[Ala（A）]的含量較高，分別占13.4%、9.3%和7.3%;蛋白脂肪系數(shù)為109.95，不穩(wěn)定系數(shù)值為45.64，屬于不穩(wěn)定蛋白。使用ProtScale預(yù)測MeETR1蛋白的親/疏水性，結(jié)果（圖2）表明，MeETR1蛋白的最大親水性為-2.767、最大疏水性為2.611，有82個氨基酸親水?dāng)?shù)峰在-1.000以下，有150個氨基酸疏水?dāng)?shù)峰在1.000以上，親水性氨基酸數(shù)目明顯少于疏水性氨基酸，為疏水蛋白。通過CD-Search預(yù)測MeETR1蛋白保守結(jié)構(gòu)域和功能域，發(fā)現(xiàn)MeETR1蛋白包括4個典型模塊，即GAF結(jié)構(gòu)域、HisKA結(jié)構(gòu)域、HATPase_c結(jié)構(gòu)域和REC結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2. 3 MeETR1蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

使用PRABI對MeETR1蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖4）表明，MeETR1基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)中有351個α-螺旋（占47.43%）、107個延伸鏈（占14.46%）及281個無規(guī)則卷曲（占38.11%）。以SWISS-MODEL預(yù)測MeETR1蛋白三級結(jié)構(gòu)，其結(jié)果（圖5）與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

2. 4 MeETR1氨基酸序列同源比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI搜索與MeETR1氨基酸同源的氨基酸序列[蓖麻（Ricinus communis）、毛果楊（Populus trichocarpa）、梅（Prunus mume）、草莓（Fragaria x ananassa）、月季（Rosa chinensis）、龍眼木（Dimocarpus longan）、柑橘（Citrus sinensis）、芒果（Mangifera indica）、獼猴桃（Actinidia deliciosa）、葡萄（Vitis vinifera）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）]，進(jìn)行多序列比對分析（圖6），并使用MEGA 7.0中的Neighor-joining法構(gòu)建基于ETR1氨基酸序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖7），結(jié)果顯示，MeETR1氨基酸序列（XP_021625986.1）與同屬大戟科的蓖麻ETR1氨基酸序列（XP_002533252.1）相似性為92.42%，且位于同一進(jìn)化分支上，即MeETR1與蓖麻ETR家族的親緣關(guān)系較近;與毛果楊（XP_002299688.1）、梅（XP_008218930.1）、草莓（CAC48384.1）、月季（XP_024181357.1）、龍眼木（ACL81480.3）、柑橘（KDO50509.1）、芒果（AIT39449.1）、獼猴桃（ABY 28264.1）、葡萄（CAN73257.1）的ETR1氨基酸序列相似性分別為88.77%、88.26%、87.85%、88.12%、88.39%、87.58%、86.52%、86.27%和85.70%，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn);與擬南芥（NP_176808.3）的ETR1氨基酸序列相似性為83.15%，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2. 5 MeETR1蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

將MeETR1基因CDS序列連接至攜帶有GFP熒光蛋白的pNC-Green-SubN表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了pNC-Green-SubN-MeETR1植物瞬時表達(dá)載體;然后以農(nóng)桿菌注射侵染煙草葉片的方式進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗，觀察GFP熒光信號在煙草葉片細(xì)胞中的分布情況，結(jié)果（圖8）顯示經(jīng)pNC-Green-SubN-MeETR1侵染的煙草葉片在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號，表明MeETR1基因編碼蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2. 6 MeETR1基因表達(dá)分析結(jié)果

MeETR1基因在木薯采后PPD過程中不同時段的表達(dá)情況如圖9所示。與0 h（PPD前）相比，MeETR1基因的相對表達(dá)量在PPD過程中（12、24、48和96 h）均呈顯著下降趨勢（P<0.05），表明MeETR1基因表達(dá)受木薯采后PPD過程的抑制，可能在此過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

3 討論

ETR是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一類包含多個基因的關(guān)鍵組分，其蛋白結(jié)構(gòu)及基因時空表達(dá)方面各不相同，因此其家族成員在逆境脅迫中可能具有多種調(diào)控模式，在不同脅迫條件下ETR基因的調(diào)控模式存在明顯差異（Gao and Schaller，2009;Bisson and Groth，2010）。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的不同通常將ETR分為兩個亞家族，其中，亞家族I受體（ETR1和ERS1）具有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結(jié)構(gòu)域;亞家族II受體包括ETR2、ERS2和EIN4，其在N-末端具有額外的信號肽，且與亞家族I受體相比具有分叉的His激酶結(jié)構(gòu)域（Yang et al.，2015）。ETR1參與植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫的多個過程，目前已從甜瓜、芒果和番茄等植物中克隆獲得ETR1基因，但關(guān)于MeETR1基因在木薯采后PPD過程中的功能作用研究尚無報道。本研究成功克隆獲得ETR1亞家族成員MeETR1基因的CDS序列，其長度為2220 bp，共編碼739個氨基酸，含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結(jié)構(gòu)域;多序列比對分析發(fā)現(xiàn)MeETR1氨基酸序列與多個物種的ETR1氨基酸序列相似性較高，均在80.00%以上，表明不同植物的ETR在生物學(xué)功能上可能具有一致性（李麗等，2018）。MeETR1基因編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，與擬南芥ETR1基因編碼蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（Chen et al.，2002;Dong et al.，2008）有所不同，可能是用于侵染的植物不同所致（Dong et al.，2010），因此后續(xù)有待利用原生質(zhì)體重新進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

ETR1作為乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的元件之一，在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中能直接與乙烯結(jié)合形成受體復(fù)合物，即ETR1在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，因此MeETR1基因在木薯中的功能可能與其他植物ETR基因相似。本研究通過實時熒光定量PCR檢測分析MeETR1基因在木薯采后PPD過程中不同時段的表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeETR1基因在0 h（PPD前）的相對表達(dá)量最高，在PPD過程中（12、24、48和96 h）其相對表達(dá)量均呈顯著下降趨勢，推測MeETR1基因在木薯采后PPD過程中具有負(fù)調(diào)控作用。在今后的研究中可通過構(gòu)建MeETR1基因過表達(dá)及干擾轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)一步解析MeETR1基因在木薯塊根采后PPD過程中的功能。

4 結(jié)論

MeETR1基因編碼蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結(jié)構(gòu)域，與其他植物ETR1在生物學(xué)功能上具有一致性;MeETR1基因表達(dá)在木薯采后PPD過程中受抑制，可能在此過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

參考文獻(xiàn)：

郝金鳳，王雪飛，怡榮，哈斯阿古拉，牛一丁. 2012. 甜瓜乙烯受體基因Cm-ETR2的克隆及其在果實發(fā)育成熟過程中表達(dá)特性的分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，27（2）：40-43. [Hao J F，Wang X F，Yi R，Hasi Agula，Niu Y D. 2012. Cloning and expression characterization of ethylene receptor gene Cm-ETR2 from melon （Cucumis melo L.）[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，27（2）：40-43.]

賀立紅，陳建業(yè)，于偉民，王勇，陸旺金. 2009. 香蕉果實乙烯受體基因克隆及其表達(dá)特性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（4）：1359-1364. [He L H，Chen J Y，Yu W M，Wang Y，Lu W J. 2009. Cloning and expression analysis of ethylene receptor in harvested banana fruit[J]. Scientia Agricultura Sinica，42（4）：1359-1364.]

黃溪. 2016. 水稻乙烯受體OsETR4在低溫脅迫中的功能研究[D]. 長春：吉林大學(xué). [Huang X. 2016. Functional analysis of ethylene receptor gene OsETR4 from rice under low temperature stress[D]. Changchun：Jilin University.]

李麗，孫健，易萍，饒川艷，李昌寶，何雪梅，零東寧，肖占仕，盛金鳳，唐雅園，李杰民，鄭鳳錦. 2018. 芒果乙烯受體ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（6）：1053-1060. [Li L，Sun J，Yi P，Rao C Y，Li C B，He X M，Ling D N，Xiao Z S，Sheng J F，Tang Y Y，Li J M，Zheng F J. 2018. Cloning and sequence analysis of ethylene receptor ETR1 and ERS1 genes from mango （Mangnifera indica L.）[J]. Journal of Southern Agriculture，49（6）：1053-1060.]

李麗秀，賴鐘雄. 2013. 早鐘6號枇杷兩個ETR基因成員的克隆及序列分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，34（2）：276-284. [Li L X，Lai Z X. 2013. Cloning and sequence analysis of two ethylene receptor genes from Eriobotrya japonica cv. Zaozhong No.6[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，34（2）：276-284.]

施怡婷，楊淑華. 2016. 中國科學(xué)家在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報，51（3）：287-289. [Shi Y T，Yang S H. 2016. Chinese scientists made breakthrough in study on ethylene signaling transduction in plants[J]. Chinese Bulletin of Botany，51（3）：287-289.]

蘇麗艷. 2019. 番茄SlETR6基因的克隆及非生物脅迫下的表達(dá)分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，34（1）：19-25. [Su L Y. 2019. Cloning and expression analysis of ethylene receptor gene SlETR6 in Solanum lycopersicum under abiotic stress[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，34（1）：19-25.]

田曉巖，楊翠萍，胡進(jìn)，閆冰玉，鞏笑笑，莊玉粉，潘英文，劉進(jìn)平. 2017. 文心蘭OnERS1全長基因克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，15（4）：1265-1272. [Tian X Y，Yang C P，Hu J，Yan B Y，Gong X X，Zhuang Y F，Pan Y W，Liu J P. 2017. Cloning and expression analysis of OnERS1 gene from Oncidium gower ramsey[J]. Molecular Plant Bree-ding，15（4）：1265-1272.]

魏紹沖，陳昆松，張玉，張望舒，丁建國. 2004. 獼猴桃果實乙烯受體基因Ad-ETR1的克隆及其表達(dá)[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，30（6）：681-686. [Wei S C，Chen K S，Zhang Y，Zhang W S，Ding J G. 2004. Cloning and expression of ethylene receptor gene Ad-ETR1 from kiwifruit[J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Bio-logy，30（6）：681-686.]

謝永紅，陳學(xué)年，呂斌，丁志祥，歐毅. 2005. 桃果實采后乙烯合成及乙烯受體ETR1同源基因表達(dá)模式的研究[J]. 西南園藝，33（3）：1-3. [Xie Y H，Chen X N，Lü B，Ding Z X，Ou Y. 2005. Ethylene biosynthesis and expression mode of ethylene receptor homolog gene ETR1 in postharvest peach fruit[J]. Southwest Horticulture，33（3）：1-3.]

顏彥，鐵韋韋，丁澤紅，吳春來，胡偉. 2018. 木薯MePYL8基因克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，16（14）：4498-4504. [Yan Y，Tie W W，Ding Z H，Wu C L，Hu W. 2018. Cloning and expression analysis of MePYL8 gene in cassava[J]. Molecular Plant Breeding，16（14）：4498-4504.]

張桂和. 2002. 巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）乙烯受體基因（etr1）的克隆及表達(dá)分析[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhang G H. 2002. Cloning and expression of ethylene receptor gene（etr1） of Hevea brasiliensis[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.]

張鵬，楊俊，周文智，王紅霞，馬秋香. 2014. 能源木薯高淀粉抗逆分子育種研究進(jìn)展與展望[J]. 生命科學(xué)，26（5）：465-473. [Zhang P，Yang J，Zhou W Z，Wang H X，Ma Q X. 2014. Progress and perspective of cassava molecular breeding for bioenergy development[J]. Chinese Bu-lletin of Life Sciences，26（5）：465-473.]

趙赫，陳受宜，張勁松. 2016. 乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與植物非生物脅迫反應(yīng)調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報，32（10）：1-10. [Zhao H，Chen S Y，Zhang J S. 2016. Ethylene signaling pathway in regulating plant response to abiotic stress[J]. Biotechnology Bulletin，32（10）：1-10.]

Bisson M M A，Groth G. 2010. New insight in ethylene signaling：Autokinase activity of ETR1 modulates the interaction of receptors and EIN2[J]. Molecular Plant，3（5）：882-889.

Chen Y F，Randlett M D，F(xiàn)indell J L，Schaller G E. 2002. Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis[J]. The Journal of Biological Chemistry，277（22）：19861-19866.

Dong C H，Jang M，Scharein B，Malach A，Rivarola M，Liesch J，Groth G，Hwang I，Chang C. 2010. Molecular association of the Arabidopsis ETR1 ethylene receptor and a regulator of ethylene signaling，RTE1[J]. The Journal of Biological Chemistry，285（52）：40706-40713.

Dong C H，Rivarola M，Resnick J S，Maggin B D，Chang C. 2008. Subcellular co-localization of Arabidopsis RTE1 and ETR1 supports a regulatory role for RTE1 in ETR1 ethylene signaling[J]. The Plant Journal，53（2）：275-286.

Gamble R L，Coonfield M L，Schaller G E. 1998. Histidine kinase activity of the ETR1 ethylene receptor from Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Scien-ces of the United States of America，95（13）：7825-7829.

Gao Z，Schaller G E. 2009. The role of receptor interactions in regulating ethylene signal transduction[J]. Plant Signaling & Behavior，4（12）：1152-1153.

Hershkovitz V，F(xiàn)riedman H，Goldschmidt E E，F(xiàn)eygenberg O，Pesis E. 2009. Induction of ethylene in avocado fruit in response to chilling stress on tree[J]. Journal of Plant Phy-siology，166（17）：1855-1862.

Ren M Y，F(xiàn)eng R J，Shi H R，Lu L F，Yun T Y，Peng M，Guan X，Zhang H，Wang J Y，Zhang X Y，Li C L，Chen Y J，He P，Zhang Y D，Xie J H. 2017. Expression patterns of members of the ethylene signaling-related gene families in response to dehydration stresses in cassava[J]. PLoS One，12（5）：e0177621.

Xu J，Duan X，Yang J，Beeching J R，Zhang P. 2013. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots[J]. Plant Physiology，161（3）：1517-1528.

Yang C，Lu X，Ma B，Chen S Y，Zhang J S. 2015. Ethylene signaling in rice and Arabidopsis： Conserved and diverged aspects[J]. Molecular Plant，8（4）：495-505.

Zidenga T，Leyva-Guerrero E，Moon H，Siritunga D，Sayre R. 2012. Extending cassava root shelf life via reduction of reactive oxygen species production[J]. Plant Physiology，159（4）：1396-1407.

Zhou X，Liu Q，Xie F，Wen C K. 2007. RTE1 is a Golgi-associated and ETR1-dependent negative regulator of ethy-lene responses[J]. Plant Physiology，145（1）：75-86.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）