不同靜壓力下脂多糖刺激牙周膜成纖維細胞對炎癥相關(guān)因子表達的影響

覃雅慶 沈慧娟 農(nóng)冬梅 周華 康娜

[摘要]目的：探討牙周炎中牙齦卟啉單胞菌LPS（Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide，Pg.LPS）和人牙周膜成纖維細胞（human periodontal ligament fibroblast， HPDLF）與正畸炎癥相關(guān)的牙根吸收作用機制。方法：取4～6代體外培養(yǎng)的HPDLF，MTT法檢測1～10μg/ml Pg.LPS對HPDLF增殖活性的影響，再選擇最佳濃度作用于HPDLF，加載0～5g/cm2靜壓力24h，實驗組分為靜壓力組和Pg.LPS+靜壓力組，通過qRT-PCR和ELISA檢測HPDLF白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）及白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果：①HPDLF增殖在1～4μg/ml Pg.LPS刺激時隨濃度增加而增加，在5～7μg/ml隨濃度增加而減少，8～10μg/ml細胞增殖明顯受到抑制;②兩組中IL-17、IL-6的表達量隨靜壓力值增加而增強，相同力值下對照組的IL-17、IL-6表達量高于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：Pg.LPS濃度過高能抑制HPDLF增殖，而適當?shù)臐舛葎t促進其增殖;Pg.LPS和靜壓力均能刺激HPDLF產(chǎn)生炎癥相關(guān)因子，參與正畸炎癥相關(guān)牙根吸收發(fā)生發(fā)展的過程。

[關(guān)鍵詞]人牙周膜成纖維細胞;白細胞介素17;白細胞介素6;牙齦卟啉單胞菌;脂多糖;靜壓力

[中圖分類號]R782.2 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）01-0079-05

Effects of Lipopolysaccharides on the Expression of Proinflammatory Factors in Periodontal Fibroblasts Stimulated by Lipopolysaccharides under

Different Static Pressure

QIN Ya-qing，SHEN Hui-jun，NONG Dong-mei，ZHOU Hua，KANG Na

（Department of Orthodontics， Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction ?Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity ?Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery Disease Treatment，

Nanning 530021，Guangxi，China）

Abstract： Objective To investigate the mechanism of Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide （Pg.LPS） and human periodontal fibroblast （HPDLF） in orthodontic inflammatory-related root resorption in periodontitis. Methods ?The HPDLF cultured in vitro for 4-6 generations was used to detect the effect of 1-10 μg/ml Pg.LPS on the proliferation of HPDLF by MTT assay. Then choose the optimal concentration stimulate HPDLF and load 0-5 g/cm2 static pressure strength for 24 hours. The experimental group was divided into static pressure group and Pg. LPS + static pressure group. QRT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the mRNA and protein expression levels of interleukin-17 and interleukin-6 in HPDLF. Results ①HPDLF proliferation increased with the increase of concentration in 1-4 μg/ml Pg.LPS stimulation， decreased with the increase of concentration in 5-7 μg/ml， and was significantly inhibited cell proliferation in 8-10 μg/ml.② The expressions of interleukin 17 and interleukin 6 in the static pressure group and Pg.LPS + static pressure group increased with the increase of static pressure value， and the expressions of interleukin 17 and interleukin 6 in the static pressure group were higher than those in Pg.LPS + static pressure group under the same force value， and the difference was statistically significant. Conclusion ?Excessive concentration of Pg. LPS inhibited the proliferation of HPDLF， and the appropriate concentration could promote the proliferation of HPDLF. Both Pg. LPS and static pressure can stimulate HPDLF to produce pro-inflammatory factors and participate in the development of orthodontic inflammatory-related root resorption， but Pg. LPS inhibits the secretion of pro-inflammatory factors by static pressure on HPDLF.

Key words： human periodontal ligament fibroblast; interleukin 17; interleukin 6; porphyromonas gingivalis; lipopolysaccharide; static pressure

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是引起慢性牙周炎的主要病原體，而LPS（Lipopolysaccharide，LPS）是其細胞壁外層的重要組成部分，可誘導炎癥相關(guān)細胞因子如IL-6的表達以及參與牙周組織的破壞[1]。IL-6被認為是經(jīng)典的骨吸收促炎細胞因子，它不僅可以通過接觸破骨前體細胞刺激破骨細胞的形成，還可以通過上調(diào)成骨細胞譜系表達核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）來刺激破骨細胞的形成[2]。IL-17是一種主要由活化的輔助性T細胞17（TH17）產(chǎn)生的致炎細胞因子，也是參與破骨細胞產(chǎn)生的主要分子之一，可增強牙周膜成纖維細胞RANKL的表達以破壞骨組織。它還通過誘導牙周炎患者的成纖維細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，介導牙周組織的破壞，相較于牙周健康者而言牙周炎患者可檢測到更高水平的IL-17[3-6]。

人牙周膜成纖維細胞作為牙周膜的重要功能細胞，調(diào)節(jié)牙周組織穩(wěn)態(tài)，形成膠原結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)揮天然免疫防御的調(diào)節(jié)功能，對正畸牙移動（orthodontic tooth movement，OTM）也起到了重要的中介作用[7]。在對牙齒施加正畸力后，HPDLF受到壓縮或拉伸的機械應(yīng)力，通過機械轉(zhuǎn)導使細胞因子和趨化因子的合成增加，特別是前列腺素和白三烯由于誘導的環(huán)氧合酶2（COX2）的活性增加而釋放，其對HPDLF和成骨細胞具有自分泌和旁分泌作用，增加可溶性和膜連接的RANKL以及炎癥相關(guān)細胞因子如IL-1、IL-6的表達，這些因子又反過來繼續(xù)增強RANKL的表達和加快基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，影響細胞外基質(zhì)的降解，從而誘導OTM[8]。

本課題組前期實驗證明，在靜壓力下IL-17在HPDLF中主要通過兩條途徑誘導RANKL產(chǎn)生從而導致破骨細胞的分化及成熟：一是HPDLF在靜壓力下生成IL-17及其他炎癥相關(guān)因子和IL-17R相連接，直接作用使HPDLF調(diào)節(jié)IL-6、RANKL和其他因子;二是IL-17與IL-17R相連接，刺激HPDLF大量產(chǎn)生IL-6，通過IL-6這條旁路進一步調(diào)節(jié)RANKL等炎癥相關(guān)因子的表達。往期研究并未完全闡明牙周炎中IL-17的作用機制，LPS對HPDLF的作用尚未完全清楚。在正畸力下，促炎細胞因子與牙周組織骨改建之間的關(guān)系更是鮮有報道。本實驗建立體外模擬正畸壓力模型，用LPS模擬牙周炎癥環(huán)境，檢測不同靜壓力下HPDLF中IL-6、IL-17的表達水平，探索各因子間的相互作用關(guān)系，為臨床上牙周炎患者在正畸治療過程中預防牙根吸收和牙槽骨退縮提供新思路。

1 ?材料和方法

1.1 實驗對象：本實驗所需組織取自筆者醫(yī)院頜面外科門診11～16歲患者因正畸需要而拔除的20顆健康前磨牙（無牙體牙髓、牙周疾?。?，均取得患者知情同意，并通過了倫理委員會同意。

1.2 實驗材料：維森特胎牛血清（澳洲血源）、DMEM培養(yǎng)基，Pg.LPS（Invivogen公司），MTT溶液（vazyme公司），DMSO溶液（Sigma公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、IL-6、IL-17、TNF-α、GAPDH上下游引物（TaKaRa公司），IL-6、IL-17 ELISAkit（武漢華美生物工程有限公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPDLF的培養(yǎng)：用無菌刀片刮下根中1/3的牙周膜組織，采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)細胞，待HPDLF從組織塊爬出并覆蓋瓶底80%時傳代培養(yǎng)。取4～6代HPDLF用做后續(xù)實驗。

1.3.2 Pg.LPS刺激下對HPDLF增殖活性的影響：將4～6代HPDLF制成單細胞懸液接種于96孔板，滴加配成10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，實驗組分10組，LPS濃度按1～10 μg/ml逐漸遞增，設(shè)置空白孔（無細胞）和對照孔（無LPS，有細胞），置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24h。采用MTT比色法檢測吸光值，觀察不同濃度的LPS對HPDLF的細胞增殖活性的影響，選取最適宜濃度進行下一步實驗。

1.3.3 不同靜壓力下Pg.LPS刺激HPDLF：取4～6代HPDLF制成細胞懸液，以2ml/皿均勻接種，在CO2溫箱中孵育。次日換液，每孔加入2ml配成10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。2～3d后待HPDLF鋪滿皿底行Pg.LPS刺激與加力處理。用PBS液沖洗2次，每孔滴加1ml配成1% FBS的DMEM培養(yǎng)液沉淀1h，加入4μg/ml Pg.LPS，使用加力附件與圓形蓋玻片放于單層HPDLF上，這時細胞的受力分別為0、1、2、3、4、5g/cm2，然后再置入CO2孵箱中孵育24h。

1.3.4 實驗檢測：收集干預后的HPDLF，提取總RNA，將其作為模版逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBRGreenI染料法進行qRT-PCR，檢測不同靜壓力作用下，IL-6、IL-17在HPDLF中的mRNA表達水平。同時收集上清液，ELISA檢測不同壓力作用下，LPS刺激HPDLF分泌的IL-6、IL-17的蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析：實驗結(jié)果用x?±s表示，運用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計，兩組比較采用配對t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 ?結(jié)果

2.1 Pg.LPS刺激下對HPDLF增殖活性的影響：Pg.LPS刺激24h后，MTT結(jié)果示1～4μg/ml時OD值持續(xù)升高，HPDLF的增殖能力較對照組增強，4μg/ml到達高峰，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），5～7μg/ml中HPDLF細胞活力逐漸下降，隨著濃度的進一步增大，HPDLF細胞活力受到抑制，8～10μg/ml組中HPDLF細胞活力明顯被抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。MTT檢測結(jié)果可得出，適宜濃度的Pg.LPS對HPDLF增殖活性有促進作用，但濃度過高則抑制其活性。

2.2 不同靜壓力下Pg.LPS刺激HPDLF IL-6和IL-17 mRNA的表達水平：qRT-PCR檢測IL-6、IL-17 mRNA的表達水平顯示，靜壓力組中，1～5g/cm2組的IL-6、IL-17的mRNA表達水平相較于空白對照組顯著升高（P<0.01），IL-6、IL-17的mRNA表達量隨力的大小增加而增加，4g/cm2達到最大，隨后開始下降。而經(jīng)4μg/ml Pg.LPS刺激HPDLF 24h后，在Pg.LPS+靜壓力組內(nèi)，1～5g/cm2組中的IL-6、IL-17的mRNA表達水平相較于Pg.LPS未加力對照組顯著升高（P<0.01），IL-6、IL-17的mRNA表達量隨力的大小增加而增加，3g/cm2達到最大，隨后開始下降。在相同力值下，Pg.LPS+靜壓力組中IL-6、IL-17 mRNA表達水平與靜壓力組相比較顯著降低（P<0.05）（見表2～3、圖2～3）。

2.3 不同靜壓力下Pg.LPS刺激HPDLF時IL-6和IL-17蛋白的表達水平：通過ELISA檢測IL-6和IL-17的蛋白表達水平，靜壓力組中，1～5g/cm2組的IL-6和IL-17的蛋白表達水平相較于空白對照組顯著升高（P<0.01），IL-6和IL-17的蛋白表達量隨力的大小增加而增加，4g/cm2達到最大，隨后開始下降。而經(jīng)4μg/ml Pg.LPS刺激HPDLF 24h后，在Pg.LPS+靜壓力組內(nèi)，1～5g/cm2組中IL-6和IL-17的蛋白表達水平相較于Pg.LPS未加力對照組顯著升高（P<0.01），IL-6和IL-17的蛋白表達量隨力的大小增加而增加，3g/cm2達到最大，隨后開始下降。

在相同力值下，Pg.LPS+靜壓力組相對于靜壓力組的IL-6蛋白表達水平降低，4g/cm2組中的差異具有顯著性;而IL-17的蛋白表達水平降低，在0～5g/cm2組的差異均具有顯著性（P<0.05）（見表4～5、圖4～5）。

3 ? 討論

正畸治療對牙齒應(yīng)用機械力使牙周膜和牙槽骨重塑，從而轉(zhuǎn)變?yōu)镺TM，機械力被轉(zhuǎn)換為負責基因轉(zhuǎn)錄物變化的生物信號，這些信號對細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)有不同的影響[9]。有研究證實，在機械力誘導下牙周組織及炎性細胞通過Wnt/β-catenin pathway、MAPKs pathway等多種傳導途徑來釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥相關(guān)因子誘導成骨細胞表達RANKL，在巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M -CSF）存在的前提下與核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結(jié)合，啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，上調(diào)RANKL及下調(diào)骨保護素（osteoprotegerin，OPG）來促進破骨細胞的分化和成熟，形成骨吸收[7-8，10]。

對于不同濃度LPS對HPDLF的增殖活性影響測定，本實驗采用了MTT比色法，結(jié)果提示：LPS可影響HPDLF的增殖活性，低濃度時其增殖加快，若作用時間長時則會表現(xiàn)毒性作用，抑制其生長;高濃度LPS對細胞有毒性作用，可抑制增殖，且刺激時間越久抑制率越高。低濃度LPS可促進HPDLF的增殖。一是直接作用，可能因LPS影響細胞內(nèi)外Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運[11]，也可能是由于LPS激活了細胞內(nèi)ephrin/Eph等信號通路而促進了細胞內(nèi)的基因表達[12];二是間接作用，LPS通過刺激細胞產(chǎn)生生物活性因子而刺激細胞增殖。但隨作用時間的增加，細胞耐受性下降，細胞過度成熟，產(chǎn)能減少，胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶等多種酶分泌增加，導致細胞裂解，然后表現(xiàn)為細胞的毒性作用[13]。高濃度LPS抑制細胞增殖可能與細胞釋放的CTOkins或介質(zhì)有關(guān)[14]。

先前實驗中靜壓力作用下HPDLF能產(chǎn)生IL-17及其余炎癥相關(guān)因子，本實驗靜壓力組證明其最佳力值為4g/cm2，此時各炎癥相關(guān)因子最易分泌。Pg.LPS+靜壓力組與對照組或空白組分泌量相比差異均有顯著性。然而相同力值下與靜壓力組比較，各炎癥相關(guān)因子分泌水平均降低，和之前實驗結(jié)果不同：患有牙周炎的大鼠注射LPS后，IL-17、IL-6等分泌水平高于正畸加力組[15-16]。分析該結(jié)果的可能原因是：一是由于該實驗不同于先前細胞實驗中的LPS濃度，低濃度下未引起炎癥反應(yīng)，因此，低濃度LPS可能抑制HPDLF的炎癥相關(guān)因子分泌;二是作用時間不夠，LPS尚未發(fā)揮作用。值得注意的是，在Pg.LPS+靜壓力組中，最適靜壓力值降低，說明在Pg.LPS作用下HPDLF能承受的力值有所降低，這類似于臨床上對牙周炎患者的正畸治療中進行輕度和持續(xù)的正畸治療的需要。

本實驗探究了Pg.LPS與靜壓力聯(lián)合作用于HPDLF產(chǎn)生的IL-17、IL-6的表達水平和影響，這從一種獨創(chuàng)性角度來了解骨改建和骨吸收的機理和機制。然而，由于該實驗未在不同時間點設(shè)置實驗對照，未從時間方面來考慮，所以該實驗設(shè)置24h或許并非Pg.LPS刺激HPDLF最適時間，后期實驗中應(yīng)調(diào)整以不同濃度LPS作用不同時間點，以期得到更全面的結(jié)果，IL-17和其他炎癥相關(guān)因子的機理和機制研究仍需進一步探索。

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[收稿日期]2019-03-28

本文引用格式：覃雅慶，沈慧娟，農(nóng)冬梅，等.不同靜壓力下脂多糖刺激牙周膜成纖維細胞對炎癥相關(guān)因子表達的影響[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（1）：79-83.