枸杞多糖對中波紫外線輻射后角質形成細胞炎癥因子表達的影響

張琛　楊亞加　楊娥

[摘要] 目的 研究青海柴達木枸杞多糖（LBP）對中波紫外線（UVB）輻射后人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞）白細胞介素1（IL-1）和白細胞介素6（IL-6）表達的影響。 方法 將體外培養(yǎng)的HaCaT細胞隨機分成5組：空白對照組、UVB輻射組、低劑量枸杞多糖組、中劑量枸杞多糖組、高劑量枸杞多糖組，空白對照組不進行任何處理，UVB輻射組（30 mJ/cm2照射40 min），低劑量枸杞多糖組（0.5 mg/mL，30 mJ/cm2照射40 min），中劑量枸杞多糖組（1 mg/mL，30 mJ/cm2照射40 min），高劑量枸杞多糖組（2 mg/mL，30 mJ/cm2照射40 min），照射前枸杞多糖預處理12 h，酶聯免疫吸附測定法（ELISA法）檢測各組細胞及上清中IL-1和IL-6的水平。 結果 與空白對照組比較，UVB輻射組細胞中IL-1的水平無明顯變化（P > 0.05），IL-6的水平明顯增高（P < 0.05）；上清中IL-1、IL-6水平明顯提高（P < 0.05）。與UVB輻射組比較，低中高枸杞多糖組無論是細胞中還是上清中IL-1、IL-6水平都明顯降低（P < 0.05）。 結論 青海柴達木枸杞多糖可降低UVB輻射后HaCaT細胞中炎癥因子的合成及分泌，減輕紫外線輻射后引起的皮膚損傷。

[關鍵詞] 枸杞多糖；人永生化角質形成細胞；中波紫外線輻射；白細胞介素1；白細胞介素6

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0020-04

[Abstract] Objective To study the effects of the Qinghai Tsaidam Basin Lyciumbarbarum polysaccharide（LBP） on the level of interleukin1 （IL-1） and interleukin6 （IL-6） in cultured human immortalized keratinocytes （HaCaT cells） after ultraviolet （UVB） irradiation. Methods HaCaT cells were cultured in vitro and randomly divided into five groups： control group， UVB radiation group （30 mJ/cm2， radiation 40 min）， LBP low dose group （0.5 mg/mL， 30 mJ/cm2，radiation 40 min） ， LBP middle dose group （1 mg/mL， 30 mJ/cm2， radiation 40 min） ， LBP high dose group（2 mg/mL， 30 mJ/cm2， radiation 40 min）. Before 12 h of UVB irradiation， LBP was added into the culture medium. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was applied to test the effects of LBP on groups of cells and the supernatant of the level of IL-1 and IL-6. Results Compared with the control group， the levels of IL-1 in the cell in the UVB radiation group had no significant change （P > 0.05）， the level of IL-6 in the cell was significantly higher （P < 0.05）. The levels of IL-1 and IL-6 in supernatant were significantly increased （P < 0.05）. Compared with UVB radiation group， LBP group of cells or in the supernatant IL-1 and IL-6 levels were significantly reduced （P < 0.05）. Conclusion Qinghai Tsaidam Basin LBP can reduce synthesis and secretion of inflammatory factors in HaCaT cells after UVB radiation factor， and reduce the skin damage caused after ultraviolet radiation.

[Key words] Lyciumbarbarum polysaccharide； Human immortalized keratinocytes； Ultraviolet radiation； Interleukin 1； Interleukin 6

據報道，反復暴露于紫外線輻射可導致皮膚炎癥、色素沉著、老化、皮膚癌[1]，而中波紫外線（UVB）是引起紫外線輻射導致皮膚光損傷的主要原因，可刺激細胞分泌炎癥因子，從而誘發(fā)炎性反應并加速細胞損傷。青海柴達木盆地盛產我國最優(yōu)質的紅果枸杞，枸杞多糖是枸杞的主要成分之一，具有增強免疫力，抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基等多方面藥理作用[2]，但抗炎作用鮮有報道。本實驗通過觀察枸杞多糖對UVB輻射后人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞）表達白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）的水平，探討枸杞多糖的抗炎作用機制，為中藥的開發(fā)探求作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

紅果枸杞購自于青海德令哈市壹葉香茶行，HaCaT細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司（批號：ZQ0044），胎牛血清（FBS）購于以色列BI（批號：1706126），PBS緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司（批號：20160915），胰酶購于北京索萊寶科技有限公司（批號：20160817），青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司（批號：20160309），DMEM培養(yǎng)基購于以色列BI（批號：0033116），IL-1細胞因子ELISA測定試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司（批號：E04620h），IL-6細胞因子ELISA測定試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司（批號：E04638h）。

1.2 實驗儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學儀器有限公司；TL20W/12飛利浦紫外線UVB燈管，上海杰圖商貿公司；UV-340A UVB輻照度監(jiān)示器，北京精密儀器商城；冷凍干燥機，ALPHAI-2，德國Christ公司；X-Mark·BIO-RAD酶標儀，BIO-RAD公司；手持勻漿儀，無錫沃信儀器有限公司。

1.3 枸杞多糖的提取

稱取干燥后粉碎的紅果枸杞粉末50 g，加三氯甲烷∶甲醇（2∶1）500 mL，60℃回流脫脂2次，每次40 min；過濾后濾渣加入80%乙醇500 mL，70℃回流脫小分子糖、苷類物質及黃酮類物質2 h，重復2次；濾渣中加入蒸餾水（液固比20∶1），72℃、200 w超聲30 min，重復3次，收集上清液；旋轉減壓濃縮上清液后加入95%乙醇至濃度為80%，攪拌，4℃過夜[3]。6000×g離心10 min，將沉淀再溶于蒸餾水中，即得粗多糖溶液。加入粗多糖溶液20%體積的Sevag試劑（三氯甲烷∶正丁醇=5∶1），振蕩20 min，6000×g離心10 min，收集上清液，重復3次。上清液旋轉蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥至粉末。測定枸杞多糖含量：精密1.0 mL，蒸餾水定容于25 mL容量瓶，吸取1 mL枸杞多糖溶液，在485 nm下測吸光度，由回歸方程計算紅果枸杞多糖含量為0.8 mg[4-5]。

1.4 HaCaT細胞的培養(yǎng)

HaCaT細胞目前多采用貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)：將HaCaT細胞以含10%胎牛血清（FBS）的DMEM為培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，并放入37℃ 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，PBS沖洗，0.25%的胰酶消化，DMEM培養(yǎng)液終止消化，當細胞達90%融合時傳代，選1～3代細胞進行實驗（每次實驗選用同一代細胞）。在超凈臺完成細胞培養(yǎng)等操作。

1.5 細胞光損傷模型的建立及分組

據文獻及預實驗結果，當處于對數生長期的HaCaT細胞生長至80%～90%融合度時，消化成細胞懸液，并按每孔1.5×104細胞/孔，每孔100 μL細胞懸液接種于6孔板，待細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍后，隨機分成空白對照組、UVB輻射組、低劑量枸杞多糖組、中劑量枸杞多糖組及高劑量枸杞多糖組，空白對照組不進行任何處理，UVB輻射組以UVB輻射劑量30 mJ/cm2照射細胞40 min，低劑量枸杞多糖組、中劑量枸杞多糖組、高劑量枸杞多糖組分別采用0.5、1、2 mg/mL枸杞多糖預處理12 h后采用相同劑量及相同時間照射，用錫箔紙緊密包住空白對照組后，置于暗處，UVB輻射組和低劑量枸杞多糖組、中劑量枸杞多糖組、高枸杞多糖組的HaCaT細胞打開培養(yǎng)板后置于日光模擬器下照射，照射后棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h[6]。

1.6 IL-1和IL-6含量測定

HaCaT細胞依“1.5”所述處理后，留取細胞上清液待用，后用PBS沖洗HaCaT細胞2遍，0.25%胰酶消化后DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心后用PBS稀釋成細胞懸液，用手持勻漿儀（無錫沃信儀器有限公司）破壞細胞以放出細胞內成分，采用ELISA法分別進行細胞內及上清液中IL-1和IL-6含量測定。以上測定嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。所有實驗均重復6次。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

與空白對照組比較，UVB輻射刺激HaCaT細胞中IL-1的含量變化不明顯，IL-6的含量明顯升高，上清液中IL-1、IL-6的含量均升高（P < 0.05）。見表1。與UVB輻射組比較，經不同濃度枸杞多糖干預后，各組HaCaT細胞和上清中IL-1和IL-6的水平均明顯下降，且隨著枸杞多糖濃度的增高，IL-1和IL-6下降的幅度明顯增大，呈明顯的劑量依賴，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

皮膚衰老是人體衰老的一個重要表現，皮膚老化分為兩種。一種是固有性老化，由遺傳因素和不可抗拒因素（如重力、機體內分泌、免疫功能隨機體衰老的改變）引起的；另一種是由環(huán)境因素（如紫外線、吸煙、風吹、接觸化學物質等）引起的外源性老化[7]。紫外線是電磁波中波長10～400 nm輻射的總稱[8-9]，自然界的紫外線光源是太陽，能穿透臭氧層對正常人皮膚產生紅斑等致病作用的主要是UVB，UVB輻射首先可刺激細胞分泌大量炎癥因子而誘發(fā)炎性反應，產生活性氧基因（ROS）引起一系列的氧化損傷，或是直接損傷DNA導致細胞凋亡[10-11]。目前已經證實，UVB能誘導角質形成細胞產生多種細胞因子，其中IL-1、TNF-α和IL-6功能廣泛，不僅能導致皮膚局部的炎性反應，還能引起全身的炎性反應。IL-1可促進角蛋白6（K6）的表達，減少致病菌對角質形成細胞的黏附，是角質形成細胞的誘導因子，可以抵御腫瘤壞死因子相關抗原誘導配體，引起角質形成細胞凋亡。IL-6對皮膚的主要作用在于可以刺激角質形成細胞生長，還能促進IL-1、TNF-α等炎癥因子作用。研究表明，IL-1α、IL-6被認為是角質形成細胞-成纖維細胞相互作用環(huán)路中的重要中介物質，角質形成細胞通過分泌IL-1α，促進成纖維細胞分泌IL-6，引起成纖維細胞大量基因表達發(fā)生變化，再反作用角質形成細胞，促進其增值[12-13]。許多實驗研究證實，HaCaT細胞經UVB照射后，IL-1、IL-6等細胞因子的分泌量明顯增加，UVB照射后立即加入IL-1、IL-6抗體，則可明顯減少細胞腫脹、破碎情況，由此證實了IL-1、IL-6在UVB造成HaCaT細胞損傷中起著至關重要的作用[14-16]。在本實驗中，用UVB 30 mJ/cm2的輻射劑量照射HaCaT細胞后24 h后，用ELISA法分別檢測細胞及上清液中IL-1、IL-6的含量，結果顯示，與空白對照組比較，UVB輻射組細胞中IL-1的水平變化不明顯，IL-6的水平明顯增高；上清中IL-1、IL-6水平明顯提高（P < 0.05），這與之前的文獻報道是一致的[17-20]。在2型糖尿病臨床治療過程中，很多患者會出現炎癥，C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6等往往存在異常升高的情況，而枸杞多糖通過抑制CRP、TNF-α、IL-6基因表達，下調CRP、TNF-α、IL-6的產生與釋放，減輕組織炎癥因子的釋放，發(fā)揮對組織的保護作用[21]。另外，在本實驗中，隨著枸杞多糖濃度的升高，相應的IL-1、IL-6的含量下降，即在一定范圍內，枸杞多糖的濃度越高，IL-1、IL-6的合成和分泌越少。Il-1、Il-6作為重要的生物活性因子，兩者之間相互作用，IL-1能增加角質形成細胞中IL-6的合成和釋放，紫外線照射角質形成細胞是通過釋放介導的IL-1自分泌或旁分泌的方式釋放IL-6[22]。

研究表明，柴達木紅果枸杞含多種維生素和人體所必需氨基酸，特別是在醫(yī)用、保健功能中起關鍵作用的枸杞多糖高達8.3%，枸杞多糖具有調節(jié)免疫、清除自由基、抑制腫瘤、延緩衰老、降血脂、降血糖、降血壓和抗疲勞等作用[2，23-24]。本實驗中，UVB輻射組與低中高枸杞多糖組比較，無論是細胞中還是上清中IL-1、IL-6水平都明顯降低（P < 0.05）。從而初步推測，枸杞多糖的光保護作用的保護環(huán)節(jié)與減少炎癥損傷程度、恢復細胞生長增殖能力及減少表皮細胞炎癥因子的分泌等有關，但是否還具有抗氧化、減少細胞凋亡等其它途徑還需要進一步的探討。

總而言之，UVB輻射后，HaCaT細胞釋放炎癥因子增多，枸杞多糖可以顯著抑制炎癥因子的釋放，且結合青海地區(qū)地處高海拔、強紫外線和缺氧的地域特色，為青藏高原藥材的開發(fā)和實際應用提供理論依據，為光損傷的保護機制及新藥的開發(fā)探求新的作用靶點。

[參考文獻]

[1] Iannacone MR，Wang W，Stockwell HG，et al. Patterns and timing of sunlight exposure and risk of basal cell and squamous cell carcinomas of the skin-a case-control study [J]. BMC Cancer，2012，12（1）：1-11.

[2] 馮彥.枸杞多糖藥理作用與臨床應用[J].中國現代藥物應用，2016（6）：278-279.

[3] 孫漢文，劉占鋒.枸杞多糖的超聲波輔助水提取與分級純化[J].食品工業(yè)科技，2009（3）：230-233.

[4] 胡仲秋，王利，王保玲，等.枸杞多糖提取及消除羥自由基活性研究[J].食品科學，2009，30（24）：93-98.

[5] 吳鄧婷.青海枸杞多糖對惡性黑素瘤A375細胞增殖與凋亡的影響[D].西寧：青海大學，2016.

[6] 王麗雯.藏雪蓮水提取物減輕UVB輻射后HaCaT細胞凋亡的機制研究[D].西寧：青海大學，2016.

[7] 任琳.皮膚的老化與預防衰老[J].家庭中醫(yī)藥，2017（1）：51-53.

[8] 吳侃.丹參酮IIA抑制UVB照射誘導的HaCaT細胞急性損傷的研究[D].北京：北京協和醫(yī)學院，2014.

[9] 李楊，安方玉，明海霞，等.黃芪多糖對中波紫外線輻射皮膚角質形成細胞損傷的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2016，23（5）：44-46.

[10] Pratheeshkumar P，Son YO，Wang X，et al. Cyanidin-3-glucoside inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation by regulating MAP kinase and NF-κB signaling pathways in SKH-1 hairless mice skin [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2014，280（1）：127-137.

[11] Martinez RM，Pinhoribeiro FA，Steffen VS，et al. Topical formulation containing naringenin：efficacy against ultraviolet B irradiation-induced skin inflammation and oxidative stress in Mice [J]. PLoS One，2016，11（1）：e0146296.

[12] Divya SP，Wang X，Pratheeshkumar P，et al. Blackberry extract inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation through MAP kinases and NF-κB signaling pathways in SKH-1 mice skin [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2015，284（1）：92-99.

[13] Lee JW，Ryu HC，Ng YC，et al. 12（S）-Hydroxyheptadeca-5Z，8E，10E-trienoic acid suppresses UV-induced IL-6 synthesis in keratinocytes，exerting an anti-inflammatory activity[J]. Exp Mol Med，2012，44（6）：378-386.

[14] Kim B，Lee Y，Kim E，et al. The interleukin-1α precursor is biologically active and is likely a key alarmin in the IL-1 family of cytokines [J]. Front Immunol，2013，4（1）：391.

[15] 呂燕紅. 枸杞葉總黃酮對UVB照射致無毛小鼠皮膚光損傷的防護作用研究[D].蘭州：蘭州大學，2016.

[16] 高薇.五味子對UVB輻射人皮膚細胞損傷的保護機制[D].北京：中國農業(yè)科學院，2015.

[17] 高揚，易若琨，宋家樂.竹葉總黃酮對UVB誘導HaCaT細胞氧化損傷的保護作用[J]. 南京中醫(yī)藥大學學報，2015（2）：165-169.

[18] 陶冶，張小卿，吳景東.絞股藍總皂苷含藥血清對皮膚光老化HaCaT細胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6的影響[J].河南中醫(yī)，2013，33（1）：48-50.

[19] 王麗新.光敏湯對HaCaT細胞表達IL-10影響研究[J].實用中醫(yī)藥雜志，2015，31（11）：985-987.

[20] 李紅光.枸杞多糖在UVB輻射人角質形成細胞氧化損傷中的保護作用[D].太原：山西醫(yī)科大學，2014.

[21] 魏燕華，成差群，徐建平.枸杞多糖對2型糖尿病大鼠視網膜炎癥因子表達的影響[J].中國藥業(yè)，2014，23（9）：12-14.

[22] Inoue K，Hosoi J，Denda M. Extracellular ATP has stimulatory effects on the expression and release of IL-6 via purinergic receptors in normal human epidermal keratinocytes [J]. J Invest Dermatol，2007，127（2）：362.

[23] 李洋，馬文平，倪志婧.寧夏枸杞體外抗氧化機理研究[J].食品科學，2014，35（1）：79-84.

[24] Concepcion P，Marta M，Yolanda G，et al. Fernblock（polypodiumleucotomos extract）：molecular mechanisms and pleiotropic effects in light-related skin conditions，photoaging and skin cancers，a review [J]. Int J Mol Sci，2016（7）：1026.

（收稿日期：2017-03-31 本文編輯：李岳澤）