紫海膽急性毒性試驗方法標準化探討

賴素群, 余露軍, 吳美慧, 曾 進, 李建軍

(廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣州510663)

由于工業(yè)三廢、城鎮(zhèn)生活垃圾、農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖使用的化肥、農(nóng)藥和禽畜糞便、海洋油氣開采、運輸船舶排放、海上事故、近海養(yǎng)殖等污染，我國渤海、東海和黃海等海域的生態(tài)系統(tǒng)大部分處于亞健康、甚至不健康的狀態(tài)，而且還有進一步惡化的趨勢[1]。環(huán)境污染常是多來源、多種類的復(fù)合污染，存在拮抗、疊加或協(xié)同作用，生物測試可綜合多種有毒物質(zhì)的相互作用，判定有毒物質(zhì)的質(zhì)量濃度和生物效應(yīng)之間的直接關(guān)系，為水質(zhì)的監(jiān)測和綜合評價提供科學(xué)依據(jù)[2]。篩選合適的海洋污染評價生物、建立標準化毒性試驗方法是目前我國亟待解決的一個問題。

海膽具有個體相對小、生命力強、適應(yīng)性廣，在實驗室控制條件下容易飼養(yǎng)、繁殖周期相對短、能分批產(chǎn)卵或連續(xù)產(chǎn)卵和產(chǎn)卵量大等特點，日本、加拿大、新西蘭和美國等國家已廣泛采用海膽監(jiān)測海洋環(huán)境的污染狀況[3,4]，我國海膽毒性試驗也開展較多[5-7]，海膽已成為海洋生態(tài)毒理學(xué)研究的模式生物。

紫海膽(Anthocidaris crassispina)屬棘皮動物門，海膽綱，正形目，長海膽科，紫海膽屬。普遍分布在我國浙江、福建和廣東各地海岸及日本南部沿海，棲息在淺海的巖礁砂石海底[8]，營養(yǎng)豐富，藥用價值高，是我國東南沿海重要的經(jīng)濟品種[9]。

海膽毒性試驗受試對象包括胚胎[5]、浮游幼蟲[6]、幼(稚)海膽[7,10]、成海膽[11]等，其中胚胎期和幼蟲期是海膽生命中對污染物最敏感的時期，美國材料與試驗協(xié)會(ASTM)于1995年制定《用海膽綱胚胎做靜態(tài)劇毒試驗的標準指南》，并于1998年、2003年、2012年修訂。胚胎毒性試驗觀察指標包括致死率、致畸率、生長發(fā)育速度等，對實驗操作人員的技術(shù)要求較高。而海膽浮游幼蟲急性毒性試驗方法比較簡單，可能具有較好的應(yīng)用前景。

試驗方法的標準化是決定毒理學(xué)安全性評價結(jié)果是否可靠的關(guān)鍵所在。影響毒性作用的因素包括毒物因素、機體因素與環(huán)境因素三個方面。參比毒物試驗可以評估受試生物對毒物的敏感性、試驗條件、試驗的適合度, 為實驗室內(nèi)和實驗室間數(shù)據(jù)比較提供了一個質(zhì)量控制標準[12]，也可評估毒性試驗的穩(wěn)定性和準確性[13]。本研究采用的重鉻酸鉀[14]、硫酸鋅[15]、3,5-二氯苯酚[16]、十二烷基硫酸鈉(SDS)[17]為國際上廣泛認可和推薦的參比毒物，以降低毒性試驗條件優(yōu)化過程中毒物因素的影響。本文在其它機體、環(huán)境因素近似的條件下(如實驗幼蟲來自同一對親膽，水質(zhì)因子、餌料和投喂量等基本一致)，研究水溫和適宜毒性試驗的起始日齡等影響紫海膽急性毒性試驗結(jié)果的關(guān)鍵因子，以期為紫海膽毒性試驗方法的標準化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫海膽

紫海膽親本來源于惠州大亞灣，實驗室馴養(yǎng)2個月以上。用注射器將1～3 mL 0.5 mol/L的氯化鉀溶液由圍口膜注入親膽，將親膽反口面向下放置于盛滿過濾海水的燒杯上，使海水淹蓋生殖孔，收集排放的精卵人工授精，洗卵3～5次，移入幼蟲養(yǎng)殖缸培育。

1.2 試劑與儀器

重鉻酸鉀(K2Cr2O7，含量≥99.8%，分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O，含量≥99.5%，分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、3,5-二氯苯酚(98.15%，分析純，上海麥克林生化科技有限公司)、十二烷基硫酸鈉(SDS，含量≥99.0%，美國Sigma進口分裝)。

電子天平(ME204E)購自梅特勒-托利多公司，顯微鏡(萊卡DM1000)購自德國萊卡公司，電導(dǎo)率儀(梅特勒SG3)、pH計(梅特勒-托利多SG2)購自梅特勒-托利多公司，溶氧儀(YSI 550A-2) 購自美國YSI公司，人工氣候箱(HSW-436)購自嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 胚胎發(fā)育 6組人工氣候箱，箱內(nèi)溫度分別設(shè)置為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃和30 ℃, 各水溫下，天然海膽受精卵，在鹽度29～30、pH 8.1、光強30～100 lx的海水中培育，幼蟲孵出24 h后開始投喂本實驗室自繁的角毛藻，餌料密度為8 000～10 000 個/mL。每3 h由各氣候箱隨機取40個胚胎或幼蟲在顯微鏡下觀察，記錄。

1.3.2 毒性試驗 參照GB/T 18420.2-2009[18]中鹵蟲試驗方法，用等比稀釋法配制試驗溶液，設(shè)定5個等比濃度組和1個空白對照組，等比系數(shù)不大于2.0，每個試驗組設(shè)定4個重復(fù)。試驗容器采用100 mL燒杯，試驗液體積為40 mL，每個容器放入10個海膽幼蟲。持續(xù)時間為96 h。試驗環(huán)境因子：水溫24～26 ℃，鹽度28～30。每日投喂一次濃縮角毛藻，保持溶液中角毛藻密度約10 000～12 000個/mL。以死亡為觀測指標，顯微鏡下觀測沉于容器底部的海膽，15 s內(nèi)腕足停止運動判定為死亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用概率單位法計算致死中濃度(LC50); 實驗數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本的t檢驗、F檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

變異系數(shù)的計算公式為：變異系數(shù) C·V =(標準偏差SD/平均值Mean)×100%

2 結(jié)果

2.1 海膽胚胎發(fā)育觀察

不同水溫條件下紫海膽發(fā)育至相應(yīng)階段所需時間見表1，當水溫為28 ℃或30 ℃時，168 h出現(xiàn)大量幼蟲沉底死亡，其中30 ℃幼蟲全部死亡; 當水溫為20 ℃時，幼蟲無法正常變態(tài)附著，直至觀察到397 h, 所有幼蟲死亡。試驗結(jié)果表明,24～26 ℃時孵化成活率較高且孵化速度較快，在此條件下，受精卵孵化至二腕幼蟲、四腕幼蟲、六腕幼蟲、八腕幼蟲、出現(xiàn)管足所需時間分別為29 h、48 h、122 h、182 h和269 h。

2.2 毒性試驗

表2～5分別為SDS、Cr6+、Zn2+、3,5-二氯苯酚對不同日齡海膽幼蟲的毒性試驗結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計分析，每種參比毒物對4日齡、6日齡、8日齡、10日齡、12 日齡海膽幼蟲的96 h LC50均無顯著性差異(P＞0.05)。各參比毒物對不同日齡海膽幼蟲LC50的變異系數(shù)為3.7%～100.9%，其中12 日齡海膽幼蟲LC50的變異系數(shù)較低。

表 1 不同水溫下紫海膽發(fā)育至相應(yīng)階段所需時間 h

2.3 參比毒物毒性大小比較

基于海膽浮游幼蟲急性毒性試驗，參比毒物對海膽幼蟲的毒性順序為: Cr6+＞Zn2+＞3,5-二氯苯酚＞SDS。

表 2 SDS對紫海膽幼蟲的96 h急性毒性

表 3 Cr6+對紫海膽幼蟲的96 h急性毒性

表 4 Zn2+對紫海膽幼蟲的96 h急性毒性

表 5 3,5-二氯苯酚對紫海膽幼蟲的96 h急性毒性

3 討論

水溫是海膽生長發(fā)育最主要的影響因子之一[19]，陳錘[20]研究表明，紫海膽適宜生長水溫為15～30 ℃, 馮雪等[21]通過對紫海膽呼吸代謝的研究, 認為紫海膽生長最適溫度為22～27 ℃，其正常生理耐受溫度亦在22～27 ℃，當水溫超過正常耐受溫度時，正常生理活動受到破壞。不同水溫下(15～31℃)紫海膽的活力與攝食實驗[9]表明，紫海膽最適攝食水溫為23～27℃。本研究表明，當水溫為28 ℃和30 ℃時，浮游幼蟲出現(xiàn)大量沉底死亡，水溫低于20℃，幼蟲無法變態(tài)附著，24～26 ℃時孵化成活率較高且孵化速度較快，是紫海膽生長發(fā)育的最適水溫，與上述研究結(jié)果一致。

變異系數(shù)(CV)，又稱“離散系數(shù)”，是概率分布離散程度的一個歸一化量度，其定義為標準差與平均值之比，常用于比較多個樣品重復(fù)測定的誤差(不精密度水平)[22]。如重鉻酸鉀對稀有鮈鯽18次重復(fù)實驗的96 h的LC50值在105.24～288.43 mg/L, CV＜35%; 3,4-二氯苯胺對稀有鮈鯽18次重復(fù)實驗的96 h LC50值在4.42～8.75 mg/L，CV＜20%[14]。一般來說，CV越小，可重復(fù)性越強。本研究中，不同日齡海膽幼蟲的96 h急性毒性試驗結(jié)果CV差別較大，為確保毒性試驗結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性，一般應(yīng)選擇CV較小的實驗條件。根據(jù)本研究，海膽急性毒性試驗適宜的起始日齡為12 d。

本研究結(jié)果表明，紫海膽對水環(huán)境污染物敏感，如SDS對受精后12日齡紫海膽的96 h LC50為3.95 mg/L，而對4～6日齡黑褐新糠蝦[23]和鹵蟲[24]的96 h LC50分別為11.6 mg/L和13.9 mg/L;Cr6+對12日齡紫海膽的96 h LC50為1.40mg/L, 而對體長為(3.0±1.0) cm稀有鮈鯽[14]和體長為(2.7±0.4) cm斑馬魚[25]96 h LC50分別為32.22 mg/L和23.60 mg/L; Zn2+對12日齡紫海膽的96 h LC50為1.69 mg/L，而對體質(zhì)量為(0.48±0.13) g中華絨螯蟹仔蟹和體質(zhì)量為(0.014 4±0.003 1) g克氏原螯蝦幼蝦的96 h LC50分別為5.84 mg/L和2.60 mg/L[26], 3,5-二氯苯酚對12日齡紫海膽96 h LC50為3.60 mg/L，而對沙蠶(Platynereis dumerilii)幼蟲48 h LC50值為3.64 mg/L，此外，且紫海膽個體小、易于實驗室飼養(yǎng)、繁殖周期短、分批產(chǎn)卵、生殖力強，是我國東南沿海生態(tài)系統(tǒng)中的重要物種，因此，紫海膽是一種較理想的海洋污染物毒性測試生物。