潤燥明目湯對急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜及其組織Caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響

萬 宇, 李戰(zhàn)梅, 黃 海, 黃學(xué)文, 何藝嵐

(南充市中心醫(yī)院眼科, 南充 637000)

高眼壓癥是從原發(fā)性開角型青光眼的診治過程中發(fā)現(xiàn)的一種特殊癥狀，在臨床實踐中也發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)確診的青光眼患者都具有眼壓升高的共同特征[1,2]。其發(fā)病機制尚未明確，但降低眼壓依然是治療青光眼最主要的措施之一。目前，青光眼的治療包括谷氨酸拮抗劑、基因調(diào)控、鈣離子阻滯劑等手段，但在不同的患者中其療效差別較大[3,4]。近年來，祖國醫(yī)學(xué)通過中醫(yī)針灸、中藥干預(yù)等特色療法在青光眼視神經(jīng)保護方面取得了重大進展[5]。潤燥明目湯對青光眼具有良好的效果，但關(guān)于其對高眼壓癥的療效研究報道較少。因此，本研究將通過構(gòu)建大鼠高眼壓動物模型初步探討潤燥明目湯保護急性高眼壓大鼠視神經(jīng)的作用及可能機制，旨在為臨床治療高眼壓癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(230±60) g, 購自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所[SCXK(渝)-2017-0005]，飼養(yǎng)于南充市中心醫(yī)院外科動物實驗室[SYXK(渝)2017-0009]。動物實驗經(jīng)南充市中心醫(yī)院動物倫理委員會審批(文號20180516089)。潤燥明目湯由我院藥劑科配置, 方劑包括生地12 g，丹皮l0 g, 白芍12 g，麥冬12 g, 石斛20 g，南沙參12 g，黃芪15 g，山茱萸12 g，淡竹葉9 g，置煎藥壺中加水煎煮30 min,去渣取汁，將汁濃縮為干膏, 其得膏率為18.2%。按不同劑量以灌胃方式給藥，每日1次。

Tono-penⅡ眼壓計購自美國Medtronic SALON 公司, 光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡均購自日本日立株式會社, 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷氨酸(Glu)及Ca2+試劑盒均購自自南京建成生物工程研究所科技有限公司，酶標儀購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 模型構(gòu)建及分組

將60只SD大鼠隨機分為6組，根據(jù)處理方式的不同分為空白組、單純模型組、陽性藥物組(銀杏葉片，210 mg/kg)、潤燥明目湯低劑量組、中等劑量組及高劑量組?？瞻捉M: 不做任何處理,正常飼養(yǎng)，采用生理鹽水灌胃每日1次3 mL。單純模型組：參考趙瑛等[6]的方法建立大鼠急性高眼壓模型，質(zhì)量分數(shù)4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，林可霉素沖洗眼部后行角膜表面麻醉。將生理鹽水瓶懸置于液平面至大鼠角膜頂點垂直距離136 cm處 (此高度可在大鼠眼內(nèi)形成 100 mmHg的眼內(nèi)壓[2])，將連接生理鹽水瓶輸液管的5號頭皮針針尖沿角膜緣刺人前房 ，為避免損傷虹膜和晶狀體，針頭斜面向上，針尖平行于瞳孔緣迅速推進，切勿穿破角膜，固定 。輕輕打開輸液器開關(guān)，當(dāng)輸液瓶內(nèi)的液體向眼內(nèi)滴注時，可見球結(jié)膜蒼白，虹膜迅速變白，用檢眼鏡檢查可發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜蒼白水腫，說明視網(wǎng)膜中央動脈的供血已被完全阻斷。持續(xù)60 min后，緩慢拔除針頭，涂擦紅霉素眼膏預(yù)防感染。分籠飼養(yǎng)，自然飲食。陽性藥物組、潤燥明目湯低、中和高劑量組：急性高眼壓模型構(gòu)建方法同單純模型組，從造模第2日開始，采用潤燥明目湯每日按10 mL/kg、15 mL/kg和20 mL/kg灌胃，給藥劑量換算為(按照臨床70 kg成人用量和體表面積進行換算), 銀信葉片給藥劑量參考相關(guān)文獻。

1.3 大鼠眼壓測量

在造模前、造模后即刻、用藥后8周共3個時間點對大鼠眼壓進行測量, 采用Tono-pen AVIA筆式眼壓計進行。測量時，先采用奧布卡因滴眼液進行表面麻醉，計量器輕觸角膜至少10次以上。記錄眼壓值。操作由1人完成，至少操作3次取平均值，測量過程中剔除顯著異常值。

1.4 HE染色

用藥8周實驗結(jié)束后采用過量麻醉法處死大鼠，取下右眼眼球，留取部分眼球后視神經(jīng)組織，質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定視神經(jīng)組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇溶液梯度水化。蘇木精染色30～60 s, 沖洗5 min, 伊紅染色30 s，沖洗5 min; 乙醇溶液梯度脫水，干燥，二甲苯透明, 中性樹膠封固, 晾干, 光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+檢測

取下視網(wǎng)膜組織，摘除晶狀體和玻璃體，小心分離視網(wǎng)膜組織，移入EP管，吸進水分后稱重，加入冰生理鹽水，剪碎。用破碎儀制作視網(wǎng)膜組織勻漿，在200r/min、室溫下離心8 min，分別參照SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+的說明書操作方法，采用比色法對各指標進行檢測。

1.6 RT-PCR檢測細胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3 Bcl-2和Bax mRNA表達

處死大鼠后, 解剖出視網(wǎng)膜組織。采用Trace試劑盒，提取DNA，洗脫后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA完整性。95 ℃預(yù)變性3 min, 95 ℃30 s, 退火溫度40 s, 72 ℃30 s, 40個循環(huán)，設(shè)置熒光反應(yīng)在每個擴增周期后80℃10 s的條件下進行，最后72 ℃持續(xù)5 min。引物模板見表1。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用s表示，組間比較的統(tǒng)計分析采用多因素方差分析檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1 CXCL12及CXCR4引物模板

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點眼壓比較

造模前, 各組大鼠的眼壓無明顯差異(P＞0.05)。造模后即刻，空白組無明顯變化，其他組大鼠眼壓顯著升高(P＜0.05)。用藥后8周, 高劑量組大鼠眼壓較模型組及低、中干預(yù)組顯著降低(P＜0.05),與陽性藥物組相比高劑量干預(yù)組其眼壓變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)

正常組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整(圖1A)。單純模型組大鼠，視網(wǎng)膜組織明顯水腫，可見空泡變性(圖1B)。陽性藥物組大鼠的神經(jīng)纖維層、細胞層水腫明顯較低，空泡樣變形較少，結(jié)構(gòu)截完整(圖1C)。潤燥明目湯低劑量組及中劑量干預(yù)組大鼠的神經(jīng)纖維層、細胞層水腫明顯，空泡樣變性較多，結(jié)構(gòu)紊亂(圖1D、E)，而高劑量干預(yù)組的視網(wǎng)膜損傷程度明顯減輕，視網(wǎng)膜水腫位置較為局限，外層組織水腫顯著減輕，大部分結(jié)構(gòu)恢復(fù)(圖1F)。

表 2 各組大鼠不同時間點眼壓比較 mmHg

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+比較

與空白組大鼠相比，單純模型組大鼠視神經(jīng)組織中SOD活性顯著降低，而MDA、NO、Glu、Ca2+水平明顯升高(P＜0.05)。與單純模型組大鼠相比，陽性藥物組及各干預(yù)劑量組大鼠的相關(guān)指標均存在顯著變化(P＜0.05)。隨著治療劑量的升高，與陽性藥物組相比，潤燥明目湯高劑量干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜組織中NO、Glu水平呈顯著下降(P＜0.05)(表3)。

圖 1 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色(HE×200)

表 3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+比較 (每mg視網(wǎng)膜組織)

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3平均積分吸光度

與空白組相比, 單純模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的Bcl-2吸光度明顯降低、Bax、Caspase-3平均積分吸光度均顯著升高(P＜0.05); 與單純模型組相比, 隨著潤燥明目湯劑量的增加, 各劑量干預(yù)組及陽性藥物組大鼠的Bcl-2平均積分吸光度均顯著增加, 其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), Bax、Caspase-3平均積分吸光度均顯著升高(P＜0.05); 與陽性藥物組相比, 而高劑量干預(yù)組大鼠Bax、Caspase-3的平均積分吸光度顯著下降(P＜0.05)(表4)。

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相對表達量

與空白組組相比, 單純模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-2 mRNA明顯降低、Bax、Caspase-3 mRNA均顯著升高(P＜0.05); 與單純模型組相比, 隨著給藥劑量的升高及陽性藥物的干預(yù), 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的Bcl-2 mRNA相對表達量逐漸升高, Bax、Caspase-3 mRNA的相對表達量逐漸下降, 均呈現(xiàn)出劑量依賴性(P＜0.05); 與陽性藥物組相比，高劑量潤燥明目湯干預(yù)組大鼠Bcl-2及Bax mRNA明顯降低(P＜0.05)(表5)。

表 4 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3平均積分吸光度

表 5 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相對表達量

3 討論

絕大多數(shù)青光眼患者因眼壓升高導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)致盲性眼病。研究[7]報道，細胞凋亡參與青光眼神經(jīng)節(jié)細胞丟失。其中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷及小梁細胞凋亡在青光眼發(fā)病過程中所發(fā)揮的作用引起研究者的關(guān)注。在高眼壓作用下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞染色體明顯濃縮、靠邊，胞質(zhì)中有多個比核小而濃縮的小體(即凋亡小體), 并有膜包繞。這種形態(tài)異常表明青光眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生凋亡。小梁網(wǎng)通常被認為在眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用, 高眼壓狀態(tài)下, 小梁細胞凋亡被激活，啟動凋亡程序，通過多種途徑打破 bcl2 家族的平衡，使 bax mRNA 表達量增加，bcl-2 mRNA表達量減少，導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生率明顯增加 。

由于缺乏警惕性，導(dǎo)致早期青光眼的隱匿性高，許多患者初次確診時就已難以根治、無法逆轉(zhuǎn)[8]。而在祖國醫(yī)學(xué)中, 將青光眼歸于五風(fēng)內(nèi)障范疇, 病因病機與機械性損傷、缺血性損傷及免疫損傷等相似, 但關(guān)于其具體發(fā)病機制也無明確共識。

本研究中, 我們初步探討潤燥明目湯對誘導(dǎo)大鼠高眼壓模型的保護機制。動態(tài)監(jiān)測眼壓后發(fā)現(xiàn),在造模后即刻, 大鼠眼壓顯著升高, 表明模型構(gòu)造成功。用藥后8周，單純模型組、低劑量組、中劑量組眼壓無明顯差異，但高劑量組大鼠眼壓顯著降低, 表明高劑量的潤燥明目湯對緩解眼高壓有一定的作用。經(jīng)HE染色后觀察視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，單純模型組大鼠的視網(wǎng)膜明顯水腫，各層結(jié)構(gòu)完整，可見空泡變性; 潤燥明目湯低劑量干預(yù)組及中劑量干預(yù)組大鼠的神經(jīng)纖維層、細胞層水腫明顯，結(jié)構(gòu)紊亂; 高劑量干預(yù)組的視網(wǎng)膜損傷程度明顯減輕，視網(wǎng)膜水腫位置較為局限, 外層組織水腫顯著減輕, 大部分結(jié)構(gòu)已恢復(fù)。這表明，高劑量的潤燥明目湯對受損的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有一定的改善功能，可部分恢復(fù)視神經(jīng)組織形態(tài), 這一結(jié)論與劉蓓等[9]研究結(jié)果相一致。

SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[10]。MDA是氧自由基與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其表達水平的高低可直接反映細胞氧化損傷的程度[11]。NO則可通過產(chǎn)生神經(jīng)毒作用誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。研究[6]表明，銀杏提取物抗氧化應(yīng)激、清除自由基、保護線粒體等多種生物功能，還能有效保護高眼壓模型的視神經(jīng)細胞的凋亡。目前, 銀杏葉片已經(jīng)作為臨床用藥。在本研究中，將銀杏葉片作為陽性藥物組，通過比色法檢測后發(fā)現(xiàn)，與單純模型組相比，各給藥劑量組及陽性藥物組的相關(guān)指標均存在顯著差異，且與陽性藥物組相比，高劑量干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜組織中NO、Glu水平呈顯著下降(P＜0.05)。這一結(jié)果表明，一定劑量的潤燥明目湯可有效抑制自由基氧化作用的同時, 其中對NO、Ca2+抑制作用強于銀杏葉片組，該結(jié)論與胡瑾等[13]研究結(jié)果相似。

Caspases家族成員是存在于胞質(zhì)溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，可以選擇性地對多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)進行高效切割，參與調(diào)節(jié)多種生物過程，如程序性細胞死亡，炎癥，細胞分化、增殖和運動[14]。BCL-2蛋白位于細胞內(nèi)膜如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體, 一些家族成員在細胞死亡的刺激下從細胞質(zhì)移位到線粒體[15], 參與調(diào)節(jié)細胞凋亡。在本研究中, 通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn), 隨著潤燥明目湯干預(yù)劑量的升高, 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的Bcl-2 mRNA相對表達量顯著升高, Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的相對表達量明顯下降，均呈現(xiàn)出劑量依賴性。而Caspases與細胞程序性死亡密切相關(guān)，當(dāng)出現(xiàn)高眼壓后，急性的缺血再灌注損傷會誘導(dǎo)大量視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡，作為細胞凋亡胞內(nèi)信號的主要傳遞者，Caspases表達量會明顯上調(diào)。在本研究中, 各干預(yù)組Caspase-3 mRNA及Bax mRNA的表達量明顯下調(diào)，表明潤燥明目湯可通過調(diào)節(jié)Caspase-3/Bcl-2/Bax信號通路活化發(fā)揮降低高眼壓、保護視神經(jīng)作用。

綜上所述，潤燥明目湯干預(yù)急性高眼壓大鼠，對視神經(jīng)有明顯的保護作用，這可能與抑制Caspase-3/Bcl-2/Bax信號通路活性有關(guān)，為臨床上治療高眼壓患者的視神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)，但具體的分子學(xué)機制有待進一步探討。