肖昆林, 張 蕊, 孫 紅, 肖昆太, 馬建兵
(1. 廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院, 廣州 510800;2. 西安交通大學附屬紅會醫(yī)院, 西安 710054;3. 廈門大學醫(yī)學院, 廈門 361000)
骨性關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種可導致患者出現(xiàn)嚴重殘疾的退行性關節(jié)疾病,以關節(jié)軟骨進行性破壞為主要特點,膝關節(jié)最常受累[1]。OA動物模型的建立是研究OA發(fā)病機制與治療方法的前提[2]。目前,OA動物模型建立的方法主要有外科手術、關節(jié)腔內注射藥物和自發(fā)性OA 3種[3]。外科手術構建OA模型的方法與臨床OA較為接近,但同時存在著創(chuàng)傷大、造模時間長等缺點。自發(fā)性OA模型與臨床OA最為相似,但其造模時間過長也不適合大力推廣。關節(jié)腔內注射藥物的建模方法所需時間較短,在疾病的研究中應用廣泛。常見的注射藥物有Ⅱ型膠原酶和碘乙酸鹽,碘乙酸鹽誘導的大鼠OA模型表現(xiàn)為關節(jié)軟骨破壞,軟骨下骨損傷,以及炎癥和關節(jié)疼痛等[4]。關節(jié)腔注射不同劑量單碘乙酸(MIA)及在不同的時間點, SD大鼠均呈現(xiàn)出OA病變, MIA注射的劑量1~10 mg/kg不等, 注射的時間1~8周不等[5,6]。然而目前為止, 尚無研究報道將OA疾病的進程和關節(jié)腔注射MIA的劑量和時間相聯(lián)系。本研究通過關節(jié)腔內注射中等劑量的MIA, 誘導膝OA大鼠模型,分別于注射MIA后1周、2周和4周處死大鼠進行觀察、檢測和關節(jié)軟骨組織病理學(OOCHAS)評分,并與臨床OA的發(fā)病進程相聯(lián)系,為后期OA發(fā)病和治療機制奠定基礎。
SPF級2月齡雄性SD大鼠24只,體質量(210±18) g,2月齡購自西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心[SCXK(陜)-2018-001]。動物實驗在西安市紅會醫(yī)院轉化醫(yī)學中心進行,[SYXK(陜)2015-002]動物實驗通過西安市紅會醫(yī)院倫理委員會審查通過(編號IACUC2017-0819)。
MIA、戊巴比妥均購自美國Sigma公司;微量注射器購自上海高鴿公司;乙二胺四乙酸(EDTA)購自科昊生物公司;質量分數(shù)4%多聚甲醛溶液購自Boster公司;OCT購自Tissue-Tek公司;HE染色試劑盒、甲苯胺藍染色試劑盒均購自Solarbio公司,冰凍切片機、解剖顯微鏡均購自Leica公司等。
將SD大鼠隨機分成2組,即模型組(18只)和對照組(6只)。2組大鼠均用3%的戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉后,取右膝關節(jié)備皮,模型組大鼠右膝關節(jié)腔內注射溶于50 μL生理鹽水的2 mg MIA,對照組大鼠右膝關節(jié)腔內注射等量的生理鹽水, 隨后將大鼠放回籠內飼養(yǎng)(每籠3只),自由飲食。
關節(jié)腔內注射1周、2周和4周后,模型組大鼠采用空氣栓塞法處死每組各6只大鼠,對照組采用同樣的方法處死每組各2只大鼠,解剖取膝關節(jié)股骨髁和脛骨平臺軟骨組織,置于解剖顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)關節(jié)色澤、平滑度、關節(jié)液性狀以及關節(jié)面的磨損情況進行膝關節(jié)OOCHAS大體評分,本研究采用雙盲法進行評分。0分:關節(jié)面形態(tài)正常;1分:關節(jié)面具有輕微的纖維化(磨損、龜裂或剝落)或關節(jié)面輕微黃染;2分:關節(jié)軟骨缺損累計軟骨淺層和中層;3分:關節(jié)面缺損達軟骨深層;4分:關節(jié)面缺損累計軟骨全層,乃至軟骨下骨。
將關節(jié)標本置于質量分數(shù)4%的多聚甲醛溶液中固定,72 h后取出,置于質量分數(shù)12.5% 的EDTA溶液中脫鈣2周,隨后放入30%的高糖溶液進行沉糖,48h后取出,用冰凍切片包埋劑(OCT)進行包埋,于冰凍切片機中制作7 μm厚冰凍切片,并放于-20℃冰箱保存。
將組織切片分別進行伊紅-蘇木素(HE)及甲苯胺藍染色,并在光學顯微鏡下對染色結果進行拍照。根據(jù)關節(jié)軟骨結構、蛋白多糖含量、軟骨細胞聚集及數(shù)量、潮線完整度等方面,采用雙盲法進行OOCHAS組織學評分,累計0~12分為輕中度癥狀,13~24分為重度癥狀。
圖1結果顯示,對照組大鼠膝關節(jié)軟骨面光滑,外觀呈淡紫色,軟骨面無充血、裂紋等。模型組大鼠造模1周后關節(jié)軟骨面略微粗糙,有小的裂隙且色澤灰暗;造模2周后關節(jié)軟骨面粗糙,光澤度消失,軟骨缺損深達軟骨中下層;造模4周后軟骨缺損累及軟骨全層,并深達軟骨下骨,股骨髁和脛骨平臺軟骨剝脫。
對照組大鼠OOCHAS大體評分為0,造模1周和2周大鼠表現(xiàn)為關節(jié)軟骨的輕度損傷,4周表現(xiàn)為輕重度。單因素方差分析結果顯示, 造模后3個時間點大體評分分值差異具有統(tǒng)計學意義(圖2)。兩組間多重比較結果顯示,造模2周和4周相對于1周,4周相對于2周,分值均顯著提高,其中4周相對于1周,差異最顯著。
圖 1 大鼠膝關節(jié)組織形態(tài)學觀察Figure 1 Morphological observation of rat knee joint
圖 2 大鼠膝關節(jié)軟骨組織OOCHAS大體評分Figure 2 Rat knee joint OOCHAS gross score
對照組大鼠(圖3a、圖4a)軟骨表層無裂隙,表層細胞呈梭形,近似水平排列;中間層細胞為圓形,散在分布;深層細胞呈柱狀排列;潮線清晰;鈣化層細胞較大,呈散在分布,軟骨基質著色基本均勻。造模1周后見大鼠軟骨面出現(xiàn)小的裂隙,軟骨細胞數(shù)量輕度減少,潮線模糊,甲苯胺藍染色輕度變淡(圖3b、圖4b)。造模2周后大鼠關節(jié)軟骨組織破壞明顯,軟骨細胞數(shù)目明顯減少,潮線消失,甲苯胺藍染色明顯變淡(圖3c、圖4c)。造模4周后大鼠關節(jié)面缺損深達軟骨下骨,潮線周圍有新生血管出現(xiàn),甲苯胺藍染色顯著變淡(圖3d、圖4d)。
圖 3 大鼠膝關節(jié)組織 HE 染色結果Figure 3 Representative histological images of HE staining after MIA intraarticular injection
圖 4 大鼠膝關節(jié)組織甲苯胺藍染色結果Figure 4 Representative histological images of toluidine blue staining after MIA intraarticular injection
對照組大鼠OOCHAS組織學評分為0,模型組大鼠1周和2周表現(xiàn)為輕中度OA,4周后表為輕重度。單因素方差分析結果顯示,造模后3個時間點大鼠OOCHAS組織學評分分值差異具有統(tǒng)計學意義。兩組間多重比較結果顯示, 造模2周和4周相對于1周,4周相對于2周,分值均顯著性提高,其中4周相對于1周,差異最顯著,與OOCHAS大體評分結果一致。
圖 5 造模后大鼠膝關節(jié)OOCHAS組織學評分Figure 5 The result of OOCHAS histological score of rat model after MIA intraarticular injection
本研究通過關節(jié)腔內注射MIA的方法誘導OA大鼠模型, 結果顯示造模1周和2周后, 大鼠活動量逐漸減少, 關節(jié)軟骨面出現(xiàn)了大小不一的缺損,股骨和脛骨平臺軟骨變薄, OOCHAS大體評分和組織學評分顯示輕中度OA癥狀,與臨床OA早中期軟骨退變的表現(xiàn)相似; 造模4周后,大鼠活動量明顯減少,并逐漸出現(xiàn)跛行,關節(jié)軟骨面破壞加重, 呈糜爛狀, 軟骨缺損深達軟骨下骨層, OOCHAS大體評分和組織學評分顯示輕重度OA癥狀,與臨床晚期的軟骨退行性變的表現(xiàn)較為接近。
在以往的研究[7]報道中, 軟骨的病理損傷被作為評估OA各項指標的“金標準”。Morais等[8]通過關節(jié)腔內注射MIA的方法建立OA大鼠模型,發(fā)現(xiàn)該OA模型表現(xiàn)出軟骨細胞的變性和凋亡,即出現(xiàn)了軟骨損傷,最終膝關節(jié)間隙變窄,疼痛加重,與人的骨關節(jié)炎癥狀相似。進一步證實了關節(jié)腔內注射MIA建立OA大鼠模型是一個良好的方法,可以在相關研究中推廣使用。
OOCHAS評分體系由國際骨關節(jié)炎學會(OARSI)在1998年根據(jù)不同種類動物的OA軟骨組織退變特征和病理學特點所構建,是一套專門用于OA的評分體系,該評分系統(tǒng)從關節(jié)軟骨整體結構、蛋白多糖含量、軟骨細胞特性、潮線完整度、骨贅形成等五個方面分不同等級對軟骨損傷的程度進行評分,能夠實現(xiàn)對OA各個時期的病理損傷進行評價[9]。本研究對膝關節(jié)軟骨從宏觀形態(tài)學觀察,組織學染色,OOCHAS評分系統(tǒng)采用雙盲法進行評分,發(fā)現(xiàn)MIA誘導的膝OA大鼠模型,隨著時間的延長,膝關節(jié)軟骨呈進行性退變,軟骨細胞外基質蛋白聚糖成分含量逐漸降低,類似于臨床膝OA的發(fā)病進程。
關節(jié)軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞類型,通過合成和分解細胞外基質維持軟骨細胞外環(huán)境的穩(wěn)定[10,11]。細胞外基質成分主要包括II型膠原和蛋白多糖[12]。Roberto等[5]通過向大鼠脛股關節(jié)腔內注射MIA,發(fā)現(xiàn)MIA對軟骨細胞中甘油醛-3磷酸脫氫酶的活性具有抑制作用,導致糖酵解中斷,細胞外基質蛋白聚糖合成的數(shù)量和質量下降,從而引起軟骨細胞凋亡。軟骨細胞的逐漸減少導致關節(jié)軟骨的組織學和形態(tài)學特征改變,最終產(chǎn)生與人OA癥狀相似的變化[13,14]。另外,用關節(jié)腔注射MIA的方法誘導OA動物模型,還具有創(chuàng)傷小、時間短、可重復性強以及相對容易操作等優(yōu)點,已被應用于許多動物實驗[15-17]。雖然MIA誘導OA大鼠模型的方法已被廣泛應用,但也存在著一些不足之處,它沒有在多個時間點與人OA的發(fā)病進程相聯(lián)系和比較,而本文恰恰彌補了這個不足。
綜上所述,本研究通過關節(jié)腔內注射單碘乙酸成功誘導了膝OA模型,并將不同時間點的結果與臨床疾病進程相聯(lián)系,為后期功能和機制研究奠定了基礎。